HC-NPs通过抑制STAT3“再教化”TAMs及其抗肿瘤效应

论文摘要

目的：探讨联氨基姜黄素纳米脂质体（HC-NPs）通过抑制STAT3信号通路，对肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的“再教化”作用及体内外的抗肿瘤效应。方法：将小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7（M1表型）与小鼠乳腺癌细胞株4T1共培养，以观察RAW264.7是否被“教化”为M2表型的E-RAW264.7（即TAMs），用流式细胞术（FCM）检测RAW264.7细胞表型分子表达及细胞内细胞因子水平变化，Western blot检测细胞STAT3及下游蛋白表达水平；再以“教化”后的RAW264.7细胞（E-RAW264.7）为研究对象，分PBS对照组，NPs对照组，HC-NPs处理组，刘氏染色检测细胞形态学变化，MTT检测细胞存活情况，Western blot检测细胞STAT3及下游蛋白表达水平，FCM检测细胞表型分子表达及细胞内细胞因子水平，观察HC-NPs对E-RAW264.7的“再教化”作用，使E-RAW264.7（M2型）回复M1表型的作用。将“再教化”RAW264.7与4T1细胞共培养，分PBS对照组，E-RAW264.7对照组，NPs预处理组（NPs-E-RAW264.7），HC-NPs预处理组（HC-NPs-E-RAW264.7），台盼蓝染色观察4T1细胞的死亡率，FCM检测细胞周期及细胞凋亡，Transwell小室检测细胞迁移能力及侵袭力，Western blot检测细胞STAT3及下游增殖、凋亡、侵袭相关蛋白表达水平。在6-8周BABL/c雌性小鼠近右下肢脂肪垫处移植4T1细胞及RAW264.7细胞。移植后第10天至第25天连续给药5次，3天一次，分为PBS对照组，NPs对照组，HC-NPs处理组及HC处理组。连续测量小鼠肿瘤体积大小，移植后第30天处死小鼠称量肿瘤重量，免疫组织化学（IHC）检测细胞增殖（Ki-67阳性细胞）及新生血管生成（CD31阳性微血管）；TUNEL染色检测细胞凋亡，HE染色显示肿瘤细胞肺转移数目；连续观察小鼠生存期至移植后第60天，检测小鼠的存活率。结果：FCM结果显示，RAW264.7与4T1细胞共培养后，被“教化”为M2表型(IL-10high，TGF-βhigh，IL-12low)，Western blot结果显示E-RAW264.7细胞p-STAT3及其下游MMP9、MMP2、VEGF蛋白表达水平升高；用HC-NPs处理E-RAW264.7细胞后，细胞形态学发生明显改变，FCM显示HC-NPs可重新回复E-RAW264.7为M1表型(IL-10low，TGF-βlow，IL-12high)。Western blot结果显示HC-NPs可明显下调E-RAW264.7细胞pSTAT3及其下游MMP9、MMP2、VEGF蛋白表达水平。经HC-NPs预处理的E-RAW264.7细胞（HC-NPs-E-RAW264.7）与4T1细胞共孵育后，不影响4T1细胞存活率和细胞凋亡，但却能显著减少S期细胞数量（P<0.05）；Transwell小室迁移及侵袭实验结果显示，与对照组相比，4T1细胞与HC-NPs-E-RAW264.7细胞共培养后，4T1细胞迁移能力及侵袭力下降，与western blot检测的相应蛋白水平变化一致。体内实验显示，HC-NPs组的小鼠肿瘤生长速度及小鼠肿瘤重量明显低于对照组；生存曲线显示，HC-NPs组小鼠生存率（80%）明显高于HC组（40%）；免疫组化结果显示HC-NPs处理组中Ki-67阳性的肿瘤细胞及CD-31阳性微血管密度都明显减少；TUNEL染色分析显示，与对照组相比，HC-NPs处理组的肿瘤细胞凋亡增加；对肺组织切片进行的肿瘤细胞计数结果显示，HC-NPs显著降低了肿瘤细胞肺转移数目。结论：HC-NPs能通过抑制STAT3信号途径，使肿瘤微环境“教化“后的巨噬细胞发生型别“再教化”，此类巨噬细胞在体外与4T1小鼠乳腺癌细胞共培养后，表现为对肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管生成等方面的抑制作用。另外，HC-NPs在体内实验中表现出显著的抗肿瘤作用，且与HC相比，延长了小鼠的生存时间，减低了毒副作用，因此HC-NPs具有良好的应用前景。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 体外实验研究HC-NPs对TAMs的“再教化”作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3.讨论
• 第二部分 体内实验研究HC-NPs对小鼠肿瘤的抑制作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附图
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文