麻疹病毒通过受体SLAM对昆虫细胞的感染及其诱发细胞凋亡的机制研究

论文题目: 麻疹病毒通过受体SLAM对昆虫细胞的感染及其诱发细胞凋亡的机制研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 刘鑫

导师: 齐义鹏

关键词: 麻疹病毒,杆状病毒表达,内质网应激,凋亡

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 已经证明淋巴细胞信号刺激因子SLAM(signaling lymphocytic activation molecule)是麻疹病毒的第二受体。我们在苜宿银线夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的极晚期启动子Ppolh下游,插入编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报道基因,构建了一种来源于杆状病毒的载体——Bacmid-egfp。利用这种带标记的重组杆状病毒感染Sf9细胞,强烈的绿色荧光说明重组杆状病毒的感染。并且,因为不是与外源基因在同一个启动子下,杆状病毒表达系统中EGFP表达对该系统没有影响。我们在Bacmid-egfp中插入Ppol控制的麻疹病毒(measles virus,MV)细胞受体SLAM基因,构建重组杆状病毒rv-egfp-SLAM。在昆虫细胞Sf9中,得到融合有六个组氨酸标签的SLAM,分子量大约为46kD。HPLC证明,经过镍柱纯化的SLAM为比较单一的蛋白。激光共聚焦证明,使用重组杆状病毒表达的SLAM定位在Sf9细胞膜表面。用纯化的蛋白做pull down,发现它可以与麻疹病毒的血凝素H蛋白相互作用,证明杆状病毒表达的SLAM可能具有麻疹病毒受体的功能。 进一步的实验证明,当用麻疹病毒感染表达SLAM蛋白的Sf9细胞时,我们可以观察到细胞融合,而且细胞的融合程度与麻疹病毒的感染复数成正相关。在mRNA水平,我们检测到麻疹病毒H基因在Sf9细胞中的转录。免疫细胞组化结果显示了麻疹病毒在SLAM-Sf9细胞中的复制。最后,流式细胞检测说明,麻疹病毒可以诱发表达

论文目录:

第一部分 研究进展部分

第一章 麻疹病毒的生物学

1.1 前言

1.2 麻疹病毒的结构

1.2.1 麻疹病毒粒子的形态学

1.2.2 麻疹病毒基因组结构

1.2.3 麻疹病毒相关蛋白

1.2.3.1 血凝素蛋白

1.2.3.2 融合蛋白

1.2.3.3 基质蛋白

1.3 麻疹病毒通过与细胞的融合而造成侵染

1.3.1 融合复合物的形成

1.3.2 麻疹病毒的感染周期

1.4 麻疹病毒基因组的复制与转录

1.4.1 RNA聚合酶

1.4.2 转录

1.4.3 RNA的复制和编辑

1.5 麻疹病毒的增殖与包装

1.6 麻疹病毒的体外培养和变异

1.6.1 疫苗毒株的分析

1.6.2 野生型病毒的分析

1.7 麻疹病毒的免疫抑制

1.8 麻疹病毒对神经系统的感染

1.9 麻疹病毒是抑制肿瘤细胞生长的天然杀手

第二章 麻疹病毒与受体的相互作用

2.1 麻疹病毒第一受体CD46的发现

2.2 膜辅助因子蛋白CD46的分子结构

2.3 CD46是一个多功能分子

2.4 SLAM是麻疹病毒的第二受体

2.5 SLAM的分子结构

2.6 SLAM与麻疹病毒引起免疫抑制的关系

2.7 麻疹病毒与两个受体的关系

2.8 麻疹病毒H蛋白对受体CD46和SLAM的表达调控

第三章 病毒感染与细胞凋亡

3.1 细胞凋亡概念

3.2 细胞凋亡的基本信号转导途径

3.2.1 死亡受体介导的细胞凋亡信号转导途径

3.2.2 线粒体介导的细胞凋亡信号转导途径

3.2.3 内质网介导的细胞凋亡信号转导途径

3.3 细胞凋亡信号转导途径的网络调控

3.3.1 三条凋亡信号转导途径的相互对话(cross-talking)机制

3.3.2 细胞器之间的凋亡信号转导网络

3.4 病毒编码的细胞凋亡抑制蛋白及作用机制

3.4.1 抑制死亡受体在细胞表面的聚集

3.4.2 抑制死亡受体与死亡配体的结合

3.4.3 抑制Bcl-2家族中促凋亡成员的功能

3.4.4 抑制Caspase的活性

3.4.5 病毒抑制细胞凋亡的生物学意义

3.5 病毒感染诱导细胞凋亡

3.6 本研究的目的和意义

3.6.1 关于麻疹病毒研究背景

3.6.2 关于HAP诱发凋亡的研究背景

3.6.3 研究麻疹病毒诱发凋亡的意义

第二部分 研究工作部分

第四章 受体SLAM介导了麻疹病毒对非允许昆虫细胞的感染

4.1 前言

4.2 材料和方法

4.2.1 细胞、病毒、抗体和试剂

4.2.2 质粒DNA的小量制备

4.2.3 质粒DNA大量提取

4.2.4 DNA片段回收

4.2.4.1 低熔点琼脂糖凝胶法

4.2.4.2 玻璃奶(Glass-milk)法

4.2.5 重组质粒的构建

4.2.5.1 线状质粒DNA的去磷酸化

4.2.5.2 DNA片段和载体的连接

4.2.5.3 转座载体的构建

4.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

4.2.7 质粒DNA的转化

4.2.7.1 常规转化法

4.2.7.2 质粒的快速转化法

4.2.7.3 质粒的电转化法

4.2.8 菌种的保存

4.2.9 菌落PCR

4.2.10 细胞培养基的配制(以Grace’s为例)

4.2.11 细胞传代培养

4.2.12 细胞的冻存与复苏

4.2.12.1 冻存

4.2.12.2 复苏

4.2.13 脂质体介导的真核细胞转染

4.2.14 外源蛋白的表达纯化

4.2.15 免疫荧光激光共聚焦

4.2.16 pull down分析

4.2.17 rv-egfp-SLAM杆状病毒感染Sf9细胞的融合

4.2.18 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

4.2.19 免疫细胞化学分析

4.2.20 流式细胞仪分析细胞凋亡率

4.3 研究结果

4.3.1 重组杆状病毒的构建和鉴定

4.3.2 SLAM融合蛋白在Sf9细胞中的表达与纯化

4.3.3 SLAM在Sf9细胞膜上的定位及其与麻疹病毒H蛋白相互作用

4.3.4 SLAM的表达使异种昆虫细胞成为麻疹病毒的敏感细胞

4.3.5 麻疹病毒在SLAM-Sf9细胞中的复制和转录

4.3.6 麻疹病毒诱导了SLAM-Sf9细胞的凋亡

4.4 讨论

第五章 麻疹病毒诱发HeLa细胞的凋亡及其机制

5.1 前言

5.2 材料和方法

5.2.1 细胞、菌株、质粒和试剂

5.2.2 DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析

5.2.3 Hoechst 33342染色

5.2.4 实时定量PCR(real-time quantitative PCR)

5.2.5 实时定量PCR的相对定量分析

5.3 研究结果

5.3.1 麻疹病毒诱发HeLa细胞凋亡的形态观察

5.3.2 麻疹病毒感染导致HeLa细胞DNA特征性降解

5.3.3 麻疹病毒感染诱发HeLa细胞核形态改变

5.3.4 麻疹病毒感染与HeLa细胞的DNA亚二倍体峰

5.3.5 麻疹病毒感染促发了细胞凋亡相关基因的应答

5.4 讨论

第六章 内源性HAP／RTN3的上调、定位和聚合与麻疹病毒诱发细胞凋亡的机制

6.1 前言

6.2 材料和方法

6.2.1 细胞、血清和试剂

6.2.2 半定量RT-PCR

6.2.3 Western blot

6.2.4 重组质粒的构建

6.2.5 免疫荧光定位

6.2.6 二硫键复合物的检测

6.3 研究结果

6.3.1 麻疹病毒对内源性HAP转录和翻译的调控

6.3.2 过表达的外源HAP的内质网定位与细胞凋亡

6.3.3 麻疹病毒感染时内源性HAP在HeLa细胞中的定位

6.3.4 麻疹病毒感染与HAP蛋白四聚体的形成

6.3.5 麻疹病毒感染引起HeLa细胞内质网的应激反应

6.4 讨论

第七章 线粒体、死亡受体途径与麻疹病毒诱导细胞凋亡机制的关系

7.1 前言

7.2 材料和方法

7.2.1 细胞、质粒、试剂和抗体

7.2.2 线粒体跨膜电位的检测(△ψm)

7.2.3 核抽提(高渗法)

7.2.4 RNAi载体的构建

7.2.5 细胞内游离Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_ⅰ)的测定

7.2.5.1 Ca~(2+)荧光探针负载

7.2.6 细胞表面蛋白的流式细胞仪定量检测

7.3 研究结果

7.3.1 麻疹病毒感染诱导HeLa细胞线粒体跨膜电位(△ψm)下降

7.3.2 麻疹病毒感染引起细胞内游离钙离子浓度升高及其与HAP表达的关系

7.3.3 麻疹病毒感染上调细胞表面TRAIL的表达

7.3.4 麻疹病毒感染下调了NFκB的亚基p65的表达

7.3.5 麻疹病毒诱发HeLa细胞凋亡可能的信号转导途径

7.4 讨论

第八章 麻疹病毒及其H蛋白相互作用短肽的筛选及功能分析

8.1 前言

8.2 材料和方法

8.2.1 病毒、细胞和试剂

8.2.2 病毒的增殖、分离和提纯

8.2.3 转座载体的构建与蛋白的表达纯化

8.2.4 噬菌体文库筛选

8.2.4.1 噬菌体十五肽文库的扩增

8.2.4.2 从培养液中提纯噬菌体粒子

8.2.4.3 制备饥饿态细胞

8.2.4.4 筛选过程

8.2.4.5 Input滴定

8.2.4.6 ELISA

8.3 研究结果

8.3.1 以麻疹病毒筛选的相互作用短肽及序列

8.3.2 与可溶性H蛋白结合的短肽及其序列

8.3.3 麻疹病毒受体SLAM蛋白56-70位氨基酸特点分析

8.3.4 麻疹病毒与NFκB和IκBα复合物的相互作用功能区预测

8.4 讨论

论文总结

创新点

参考文献

在读期间发表论文

致谢

发布时间: 2006-03-27

参考文献

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