创伤弧菌溶血素基因在大肠杆菌中的高效表达和鉴定

论文摘要

目的:创伤弧菌（Vibrio vulnificus,Vv）自然存在于近海和海湾的海水和海底沉积物中,属低度嗜盐菌。人通过进食生的牡蛎,经胃肠道粘膜或破损的皮肤接触海水而感染创伤弧菌。创伤弧菌感染后病情发展迅速,最终发展为感染性休克、多器官衰竭而死亡,死亡率高达70%。创伤弧菌的致病性与许多毒力因子有关,包括溶血素、脂多糖、荚膜多糖、弹性组织蛋白激酶和金属蛋白激酶等。研究发现胞外溶血素基因（Vibriovulnificus cytolysin,vvc）是重要的致病因子之一,参与了细菌入侵宿主的毒力机制。本文通过构建创伤弧菌溶血素基因（vvc）的融合表达载体,并实现创伤弧菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达,为今后的进一步研究提供依据。方法:根据GenBank公布的创伤弧菌vvc基因核苷酸序列自行设计了一对引物,并在5’-端与3’-端分别增加BamHⅠ和HindⅢ酶切位点,应用PCR技术从一株创伤弧菌基因组中扩增了vvc基因,PCR产物经BamHⅠ和HindⅢ双酶切回收后,定向插入pET-32a（+）原核表达载体,提取pET32a（+）-vvc重组质粒,进行双酶切并测序,将测定结果与GenBank中已报道的序列进行同源性分析。结果正确后将构建的重组质粒转化于E.coli BL21（DE3）工程菌株中,IPTG诱导表达,表达产物行SDS-PAGE并进行Westernblot鉴定。结果:构建了pET-32a（+）-vvc融合表达载体,DNA测序证明,获得的vvc基因长度为1311bp,与GenBank中报道的创伤弧菌溶血素基因序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,表达的产物为71kDa左右的融合蛋白,该条带出现于经离心处理的沉淀样品中,显示重组的融合蛋白以包涵体的形式获得成功表达。并用灰度扫描软件分析显示,BL21（DE3）菌株融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot结果显示,含有重组质粒pET32a（+）-vvc的BL21（DE3）的诱导表达产物,只与鼠抗Vv血清发生结合,并在Mr为71kDa处可见明显的杂交信号,表明鼠抗Vv抗体能与目的融合蛋白发生特异性结合。结论:从创伤弧菌的总DNA中克隆了胞外蛋白vvc基因,成功地构建了pET32a（+）-vvc重组质粒,并在大肠杆菌中实现了高效表达和鉴定。本研究为进一步深入了解VVC蛋白的生物学活性,以及诊断试剂盒的制备、阐明该菌的致病机制奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 重组质粒pET32a（+）-vvc的构建和vvc基因的测序
• 1 材料与仪器
• 2 试验方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二部分 重组质粒pET32a（+）-vvc在大肠杆菌中的高效表达和鉴定
• 1 材料与仪器
• 2 试验方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢
• 附录Ⅰ 缩略词表
• 附录Ⅱ vvc测序图
• 附录Ⅲ pET32a（+）图
• 附录Ⅳ 溶液的配制