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小麦近缘种谷蛋白新亚基鉴定与编码基因克隆及其分子进化分析

2020-11-22阅读(702)

小麦近缘种谷蛋白新亚基鉴定与编码基因克隆及其分子进化分析

论文摘要

小麦谷蛋白是贮藏蛋白中的主要成分，由高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）和低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）两部分组成。HMW-GS与LMW-GS的含量及组成可直接影响小麦面粉的加工和烘烤品质。研究显示，粗山羊草（Aegilops tauschii，DD，2n=2x=14）的Glu-1Dt位点编码的HMW-GS变异类型丰富，且大多为普通小麦中尚未发现的新类型。栽培一粒小麦（Triticum monococcum L．，AmAm，2n=2x=14）的Glu-1Am位点编码的LMW-GS等位基因出现的变异频率也非常高，因此从小麦近缘种中寻找新的候选优质谷蛋白基因对小麦品质改良具有重要意义。本研究以粗山羊草和栽培一粒小麦为材料，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF×SDS-PAGE）、高效毛细管电泳（HPCE）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等多种方法对HMW-GS和LMW-GS进行分离和鉴定，然后设计等位基因特异PeR（AS-PCR）引物对其编码基因进行分子克隆、序列测定与结构比较，分析贮藏蛋白基因家族的分子进化关系和预测谷蛋白的二级结构特征，并将来自粗山羊草和硬粒小麦的HMW-GS编码基因连接到表达载体上，使其在E．coli中高效表达，初步探讨其表达特性。主要研究结果如下： 1．粗山羊草HMW谷蛋白新亚基的分离与鉴定 利用SDS-PAGE，在粗山羊草T16、T132和T128中初步鉴定出了3个新的x-型HMW-GS，分别命名为1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t，同时发现一些新的亚基组合，如1Dx1.6t+1Dy12.4t，1Dx3t+1Dy10.1t和1Dx5.2t+1Dy12t。然后采用IEF×SDS-PAGE、HPCE和RP-HPLC三种分离方法对以上新亚基和亚基组合进一步表征和鉴定。结果发现，2-DE分离除1Dy12t和1Dy10.1t亚基外，其他亚基均分离出不同的多个蛋白组分，1Dx型亚基一般包括2-4个蛋白点。同时，在HPCE图谱中，这些亚基多表现为一个主峰加1-2个副峰，由此推测这些HMW-GS可能存在蛋白质的翻译后修饰。对粗山羊草HMW-GS的RP-HPLC分析表明，1Dx亚基疏水性大于1Dy亚基，这反映了它们理化性质的不同。MALDI-TOF-MS测得的1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t亚基的精确分子量分别为88565.8 Da、86934.5 Da和86651.2 Da。 2．粗山羊草HMW-GS编码基因的分子克隆、序列比较和进化分析

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 一、小麦种子蛋白的组成
  • 二、小麦贮藏蛋白的分离分析方法
  • 1.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
  • 2.酸性-聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）
  • 3.反相高效液相色谱（RP-HPLC）
  • 4.高效毛细管电泳（HPCE）
  • 5.双向凝胶电泳（2-DE）和生物质谱分析
  • 三、小麦高分子量谷蛋白（HMW-GS）
  • 1.HMW-GS的编码位点与遗传多态性
  • 2.HMW-GS的氨基酸序列与结构特征
  • 3.HMW-GS的合成积累规律
  • 4.HMW-GS与小麦品质的关系
  • 四、低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）
  • 1.LMW-GS的组成
  • 2.LMW-GS的分类
  • 3.LMW-GS的染色体定位
  • 4.LMW-GS的分子结构
  • 5.LMW-GS的空间结构特征和在形成谷蛋白多聚体中的作用
  • 6.小麦近缘种与其他谷物中的LMW-GS
  • 7.LMW-GS的合成与加工
  • 8.LMW-GS基因的调控机制
  • 9.LMW-GS对品质的影响
  • 五、分子生物学方法在谷蛋白研究上的应用
  • 1.谷蛋白编码基因的分子克隆
  • 2.谷蛋白亚基的体外表达
  • 3.分子标记技术
  • 4.谷蛋白亚基的转基因研究
  • 六、立题依据和论文设计
  • 1.粗山羊草中HMW-GS的鉴定和x-型编码基因的克隆
  • 2.粗山羊草与硬粒小麦HMW-GS基因的原核表达
  • 3.一粒小麦LMW-GS亚基的分离鉴定和基因克隆
  • 第二章 粗山羊草高分子量谷蛋白亚基的分离与鉴定
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
  • 2.等电聚焦双向凝胶电泳（IEF×SDS-PAGE）
  • 3.高效毛细管电泳（HPCE）
  • 4.反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析
  • 5.质谱（Mass Spectrometry,MS）分析
  • 三、结果与分析
  • 1.粗山羊草HMW-GS的SDS-PAGE电泳鉴定
  • 2.粗山羊草谷蛋白亚基2-DE（IEF×SDS-PAGE）电泳鉴定
  • 3.粗山羊草HMW-GS高效毛细管电泳（HPCE）鉴定
  • 4.粗山羊草HMW-GS反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析
  • 5.粗山羊草HMW-GS质谱（MALDI-TOF-MS）分析
  • 四、讨论
  • 1.粗山羊草HMW-GS的SDS-PAGE和IEF×SDS-PAGE电泳
  • 2.粗山羊草HMW-GS的HPCE和RP-HPLC分析
  • 3.粗山羊草HMW-GS的MS分析
  • 第三章 粗山羊草高分子量谷蛋白亚基编码基因的克隆、序列测定及分子进化分析
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 1.仪器设备
  • 2.种子基因组DNA提取
  • 3.PCR扩增
  • 4.PCR产物的克隆
  • 5.序列比较、进化分析和二级结构的预测
  • 三、结果与分析
  • 1.粗山羊草HMW-GS编码基因的PCR扩增和克隆
  • t、1Dx5.2t和1Dx3t基因及蛋白序列分析'>2.1Dx1.6t、1Dx5.2t和1Dx3t基因及蛋白序列分析
  • t、1Dx5.2t和1Dx3t与已克隆的x-型和y-型HMW-GS的蛋白序列比较分析'>3.1Dx1.6t、1Dx5.2t和1Dx3t与已克隆的x-型和y-型HMW-GS的蛋白序列比较分析
  • 4.半胱氨酸残基的比较
  • 5.x-型亚基成熟蛋白氨基酸组成比较
  • t、1Dx3t和1Dx5.2t亚基编码区中单核苷酸多态性（SNPs）的分析'>6.1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t亚基编码区中单核苷酸多态性（SNPs）的分析
  • 7.分子进化分析
  • 8.HMW-GS二级结构的预测
  • 四、讨论
  • 1.1Dx型HMW-GS的分子克隆
  • 2.HMW-GS的序列结构特征及对品质的影响
  • 3.HMW-GS重复序列变异和氨基酸组成
  • t、1Dx3t和1Dx5.2t中SNPs和HMW-GS分子进化分析'>4.1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t中SNPs和HMW-GS分子进化分析
  • 5.HMW-GS二级结构的预测
  • 第四章 高分子量谷蛋白亚基编码基因在大肠杆菌中的体外表达
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 1.表达载体和菌株
  • 2.HMW-GS编码基因表达载体的构建
  • 3.HMW-GS编码基因的蛋白表达及提取方法
  • 4.Western Blotting
  • 三、结果与分析
  • 1.HMW-GS编码基因原核表达载体的构建
  • 2.HMW-&GS编码基因原核表达载体的蛋白表达
  • 3.Western Blotting分析
  • 四、讨论
  • 1.HMW-GS编码基因的E.coli表达
  • 2.HMW-GS编码基因表达条件的优化
  • 3.HMW-GS编码基因表达的展望
  • 第五章 栽培一粒小麦中低分子量谷蛋白亚基编码基因的分子克隆与鉴定
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 1.LMW-GS的碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
  • 2.LMW-GS蛋白质转印与N-端微量测序
  • 3.LMW-GS的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析
  • 4.种子基因组DNA提取
  • 5.PCR扩增
  • 6.分子克隆与DNA测序
  • 7.SNPs鉴定、序列比较与进化分析
  • 三、结果与分析
  • 1.栽培一粒小麦中IMW-GS的特征
  • 2.栽培一粒小麦中LMW-GS编码基因的PCR扩增和分子克隆
  • 3.栽培一粒小麦中三个新的LMW-i型谷蛋白亚基的序列特征分析
  • 4.LMW-GS核酸与蛋白序列的比较分析
  • 5.LMW-M1、LMW-M3和LMW-M5基因编码区中的SNPs和InDels
  • 6.LMW-GS与其它醇溶蛋白（Prolamins）基因的进化分析
  • 7.LMW-GS蛋白二级结构的预测
  • 四、讨论
  • 1.LMW-GS的结构特征及其功能特性
  • 2.不同谷物中麦醇溶蛋白（Prolamin）基因的遗传进化关系
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢

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