论文摘要
人胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）是从植入前早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）或原始生殖细胞（primordialgerm cells,PGCs）中分离得到并能在体外长期培养的高度未分化的全能细胞系。在体外特定的、适宜的培养体系中,人ES细胞可长期无限增殖,同时仍保持不分化状态和多向分化潜能。在体外可以诱导其分化成特定组织的成熟细胞,如神经细胞、心肌细胞、胰岛细胞和造血细胞等,成为神经退行性疾病、心肌梗塞、糖尿病和血液病等疾病细胞移植治疗的一个重要细胞来源。人ES细胞系首先是由Thomson等和Shamblott等于1998年分别从ICM和PGCs建立。人ES细胞一经建立便立即成为生物医学领域最具吸引力的热点。人ES细胞体外培养条件比较苛刻,条件不宜时容易自发分化。人ES细胞体外培养方式可分为有饲养层培养和无饲养层培养。有饲养层培养即将人ES细胞培养在鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonicfibroblasts,MEFs）上,然而该培养方式易引起鼠源性蛋白的污染而给人ES细胞的临床运用带来困扰。无饲养层培养则是使用源于MEFs并添加了碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growthfactor,bFGF）的条件培养基（conditional medium,CM培基）进行培养,其操作较繁琐,费用较高,不适于大规模培养。要找到一种合适、简便高效的人ES细胞培养方法,首先必须了解人ES细胞维持自我更新和多潜能性的分子机制。最近,有多个研究小组报道通过在成体细胞中过表达多个与ES细胞自我更新相关的基因可逆转成体细胞的分化状态,诱导其转变成多潜能的干细胞。这些研究不仅为干细胞临床移植治疗开辟了新的道路,同时也凸显了ES细胞自我更新机制研究的重大意义。文献报道显示:多种因素参与调控人ES细胞自我更新,其中包括转录因子（Oct-3/4、Nanog、Sox2等）、信号通路（TGFβ信号通路、Wnt信号通路、FGF和PI3K信号通路等）、细胞周期调控因子、microRNA、染色体稳定性及DNA甲基化等。Oct-3/4、Nanog、Sox2是目前研究较多的参与调控人ES细胞自我更新的转录因子,它们之间可相互作用形成复杂的转录调控环路,共同维持人ES细胞的多潜能性。除了上述几个关键基因之外,近来研究表明人ES细胞中还存在其它已知或未知基因参与其自我更新的调控过程,然而它们在人ES细胞中的功能及调控机制远未阐明。本实验室通过比较未分化的人ES细胞（H9细胞）和7天拟胚体（7-day embryoid bodies,7-day EBs）的基因表达谱,通过EST拼接、5’-RACE等方法克隆得到的一个人胚胎干细胞特异性表达新基因并命名为人胚胎干细胞相关基因（human embryonic stem cellrelated gene,HESRG）。生物信息学预测HESRG有两个候选开放阅读框（open reading frames,ORFs）,分别命名为HESRG1、HESRG2。HESRG1的起始密码子CTG位于2-4bp处,终止密码子位于668-670bp处;编码由222个氨基酸残基组成的蛋白质,预测分子量为24kD。HESRG2的起始密码子ATG位于2245-2247bp处,终止密码子位于2485-2487bp处,编码由80个氨基酸残基组成的蛋白质,预测分子量为8.7kD。然而生物信息学预测的结果仍需要进一步的实验证实,因此本课题的主要研究目的有两个:一、确定HESRG基因的ORF及其编码蛋白的亚细胞定位;二、利用转基因策略研究过表达HESRG对人ES细胞生物学特性的影响。【检测HESRG1的蛋白表达、亚细胞定位及过表达HESRG1对人ES细胞生物学性状的影响】HESRG1为HESRG基因的候选ORF之一,通过RT-PCR方法克隆HESRG1序列,将该序列克隆至pEF/His（C）载体与pCMV-Tag4A载体中,构建得到重组质粒（pEF/HESRG1,pcflag-HESRG1）。利用Fugene 6转染试剂将pEF/HESRG1导入H9细胞,通过G418筛选获得抗性克隆,进一步采用RT-PCR,Real-time PCR检测HESRG1的mRNA表达,Western blot检测Xpress与HESRG1融合蛋白的表达。将pcflag-HESRG1导入H9细胞,72小时后通过间接免疫荧光实验观察flag与HESRG1融合蛋白的亚细胞定位。Westernblot结果显示,在转染重组质粒pEF/HESRG1的H9细胞（H9-HESRG1细胞）中可检测到融合蛋白的表达,同时间接免疫荧光实验结果表明HESRG1蛋白分布于细胞核内,与生物信息学预测结果一致,我们推断HESRG1是HESRG基因的ORF。我们随后检测过表达HESRG1对人ES细胞的生物学特性的影响:实验结果显示,人ES细胞过表达HESRG1后,其细胞形态发生明显改变,不再呈克隆性生长的未分化ES细胞形态,而变成多形性、分散生长的、分化的人ES细胞形态,而且细胞的增殖速度明显减慢。Real-time PCR在mRNA水平检测人ES细胞多潜能标志基因Oct-3/4、Nanog,外胚层标志基因Sox1、FGF5、Nestin,中胚层标志基因BRACHYURY（T）、Hand1,内胚层标志基因GATA4、GATA6,滋养层标志基因CGα和CGβ的表达情况,结果显示中胚层标志基因Hand1明显上调,而其它胚层标志基因改变不明显。间接免疫荧光在蛋白质水平检测各胚层分化标志基因（Nestin、Hand1、GATA4）的表达,结果显示H9-HESRG1细胞内中胚层标志基因Hand1表达呈强阳性,而其它胚层标志基因无明显改变,说明过表达HESRG1将促使人ES细胞向中胚层方向分化。平板克隆实验观察H9-HESRG1细胞的克隆形成能力,结果显示H9-HESRG1细胞克隆形成能力低下。同时MTT法检测细胞的增殖能力,结果表明H9-HESRG1细胞的增殖能力明显低于转染空载体的H9细胞（H9-EF1细胞）。证实过表达HESRG1将会导致人ES细胞增殖能力、克隆形成能力均下降。【检测HESRG2的蛋白表达及其过表达对人ES细胞生物学性状的影响】HESRG2为HESRG基因的第二个候选ORF。通过RT-PCR的方法扩增HESRG2序列,将该序列克隆到pEF/His（B）载体中,构建重组质粒（pEF/HESRG2）。将pEF/HESRG2导入H9细胞,经G418筛选获得抗性克隆（H9-HESRG2细胞）,进一步通过RT-PCR,Real-time PCR在mRNA水平上检测HESRG2的表达,Western blot检测Xpress与HESRG2融合蛋白的表达情况。结果表明我们无法在H9-HESRG2细胞中检测到融合蛋白的表达。我们随后检测了过表达HESRG2对人ES细胞的生物学特性的影响:H9-HESRG2细胞与未转染和转染空载体的人ES细胞（H9-EF2细胞）在形态上无明显差异,均表现为未分化人ES细胞的形态。MTT法测定细胞生长曲线,观察H9-HESRG2细胞增殖能力。结果显示,过表达HESRG2对人ES细胞的增殖能力没有明显影响。流式细胞分析结果表明过表达HESRG2后,H9-HESRG2细胞的周期分布（包括G1期、S期和G2-M期）没有明显改变。通过拟胚体形成实验,检测H9-HESRG2细胞的体外分化能力,未发现H9-HESRG2细胞与H9-EF2细胞形成的拟胚体在形态上有明显差别。同时我们采用RT-PCR方法检测不同时期两组细胞形成拟胚体中各个胚层标志基因的表达情况,结果也显示H9-HESRG2细胞与H9-EF2细胞形成的拟胚体各个胚层标志基因在相同时期没有显著差异。综上所述,我们认为HESRG2可能位于HESRG基因的非翻译区,并不编码蛋白质,过表达HESRG2对人ES细胞的生物学特性没有显著影响。总之,通过本课题研究,我们认为HESRG1是HESRG基因的ORF,编码的蛋白质定位于细胞核内;HESRG的表达水平须保持在一定的范围内才能维持人ES细胞的未分化状态,过表达HESRG1能促使人ES细胞向中胚层方向分化,并导致人ES细胞的增殖能力及克隆形成能力明显下降;HESRG2可能位于HESRG基因的非翻译区,单独过表达HESRG2对人ES细胞的生物学特性或自我更新没有产生明显的作用。