极端嗜热蛋白Ssh10b的热稳定机制研究

论文摘要

比较极端嗜热蛋白与同源嗜温蛋白,有显著性差别的是极端嗜热蛋白含有较多的盐桥及带电残基,其他参数的差异仅仅有统计倾向性。然而,大量有关电荷相互作用是否维持蛋白稳定的实验结果却相互矛盾。本工作以极端嗜热蛋白Ssh10b为模型,主要研究盐桥以及带电残基与蛋白热稳定性的内在联系。理论分析提出:盐桥对温度变化的极度不敏感使得它成为蛋白在高温条件下维持稳定的重要因素。这一理论很好的解释了盐桥与蛋白热稳定性的内在关系,但是,至今没有实验证据。本研究通过双突变循环测定了Ssh10b分子中两个最为保守的盐桥在不同温度下的耦合自由能。结果显示,尽管Ssh10b的稳定自由能随着温度升高而显著下降,但这两个盐桥对蛋白稳定能的直接贡献却几乎不随温度改变,证明了盐桥是高温条件下维持蛋白稳定的重要因素。通过比较本研究的实验结果和一些已经发表的数据,我们发现总体上那些由两个在一级序列上离得较远的残基所形成的盐桥对蛋白稳定能的直接贡献明显要大于那些由两个在一级序列上离得很近的残基所形成的盐桥,这一发现对蛋白质工程颇有意义。本研究中,我们还通过理论分析提出:在中性pH区域,带电残基可解离基团的pKa漂移所引起的蛋白天然态构象熵增加可以促进蛋白稳定。酸碱滴定实验显示,相对于变性态,天然态Ssh10b中有许多可解离基团的pKa发生了漂移。理论计算结果显示一些碱性残基可解离基团的pKa发生了向下漂移,这使得在中性pH区域,天然态时构成蛋白的酸碱平衡分布远比在变性态中更为混乱,由此增加了天然态蛋白的构象熵,从而极大地提高了Ssh10b稳定性。此外,为了研究脯氨酸残基对蛋白稳定的贡献,我们表达纯化了一系列有关脯氨酸的Ssh10b突变体,进行了相关的去折叠实验;提出了一个包含脯氨酸异构化平衡的去折叠模型,根据模型,脯氨酸残基对蛋白稳定能的贡献依赖于其天然态及变性态异构化平衡分布;实验结果与模型预测完全吻合。实验结果还显示,天然态时脯氨酸的异构化导致的构象熵增加可以促进Ssh10b的稳定,从而间接为可解离基团pKa漂移可以促进蛋白稳定这一观点提供了实验证据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 嗜热和极端嗜热蛋白的热稳定机制研究进展
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 嗜热和极端嗜热蛋白的结构特征
• 1.1.2.1 嗜热和极端嗜热蛋白的一级结构特征
• 1.1.2.2 嗜热和极端嗜热蛋白的二级结构特征
• 1.1.2.3 嗜热和极端嗜热蛋白的三级结构特征
• 1.1.2.4 嗜热和极端嗜热蛋白的四级结构特征
• 1.1.3 额外的分子内相互作用可增加蛋白的热稳定性
• 1.1.3.1 电荷相互作用
• 1.1.3.2 氢键
• 1.1.3.3 疏水作用
• 1.1.3.4 二硫键
• 1.1.3.5 金属离子的结合
• 1.1.4 翻译后修饰和外环境的影响
• 1.1.5 结论和展望
• 1.2 极端嗜热蛋白 Ssh10b 的研究进展
• 1.2.1 Sac 蛋白家族及 Ssh10b 的发现
• 1.2.2 Ssh10b的结构和功能
• 1.2.3 Ssh10b 的高度热稳定性
• 1.3 圆二色光谱技术在蛋白质科学中的应用
• 1.3.1 圆二色光谱的原理
• 1.3.2 圆二色光谱仪的结构及工作原理
• 1.3.3 圆二色光谱技术在蛋白质科学中的应用
• 1.3.3.1 通过远紫外CD 光谱预测蛋白质二级结构
• 1.3.3.2 蛋白质近紫外CD 光谱表征三级结构信息
• 1.3.3.3 通过紫外-可见光CD 光谱分析辅基的耦合信息
• 1.3.3.4 通过CD 光谱研究蛋白质的构象变化
• 1.3.3.5 通过CD 研究蛋白质的折叠
• 1.3.4 圆二色光谱技术在蛋白质科学中的应用前景和展望
• 1.4 本论文的主要研究内容和主要贡献
• 第2章 盐桥是蛋白 Ssh10b 热稳定的重要因素
• 2.1 本章引论
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 菌株和质粒
• 2.2.1.2 酶及生化试剂
• 2.2.1.3 试剂盒
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 重组质粒的构建
• 2.2.2.2 蛋白的表达与纯化
• 2.2.2.3 通过 CD 监测 Ssh10b 及其突变体蛋白的去折叠
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 突变体的构建
• 2.3.2 蛋白的表达和纯化
• 2.3.3 脲诱导的去折叠
• 2.3.4 温度诱导的去折叠
• 2.3.5 通过构建 DMC 来计算盐桥对稳定能的直接贡献
• 2.4 讨论
• 2.4.1 盐桥对蛋白稳定能的直接贡献不受温度变化影响
• p'>2.4.2 盐桥数量的增加可降低蛋白的ΔC_p
• 2.4.3 盐桥E36/K68 和E54/R57 对蛋白稳定能贡献差异的原因
• 2.5 本章小结
• 第3章 蛋白 Ssh10b 天然构象是酸碱平衡分布系宗
• 3.1 本章引论
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 Ssh10b 的表达和纯化
• 3.2.2.2 Ssh10b 的酸碱滴定
• 3.2.2.3 Ssh10b 中可解离基团 pKa 的理论预测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 Ssh10b 的表达和纯化
• 3.3.2 Ssh10b 的酸碱滴定
• 3.3.3 Ssh10b 中可解离基团 pKa 的理论预测
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第4章 脯氨酸对蛋白稳定能的贡献依赖于异构平衡分布
• 4.1 本章引论
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 重组质粒的构建
• 4.2.2.2 蛋白的表达与纯化
• 4.2.2.3 分析超离心
• 4.2.2.4 通过 CD 监测 Ssh10b 及其突变体蛋白的去折叠反应
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 突变体的构建
• 4.3.2 蛋白的表达和纯化
• 4.3.3 Ssh10b 在溶液中存在着两种构象
• 4.3.4 Ssh10b 及其突变体蛋白的 CD 指纹图谱
• 4.3.5 脲诱导的去折叠
• 4.3.6 温度诱导的去折叠
• 4.4 讨论
• 4.4.1 脯氨酸残基对蛋白稳定能的贡献依赖于异构平衡分布
• 4.4.2 天然态构象熵增加可以促进蛋白稳定
• 4.5 本章小结
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果