张晓春周燕萍（宜宾市第二人民医院药剂科四川宜宾644000）
【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）19-0031-03
【摘要】目的通过胶原酶消化法对大鼠胰腺组织经过短时消化，以获得大量纯度高和功能良好的大鼠胰岛单层细胞，以此为材料研究了孜亚比提片对大鼠胰岛细胞生长和胰岛素释放的影响。方法胰岛细胞分为正常对照组、不同浓度HZT组（20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml）、高糖组、高糖+不同浓度HZT组（20g/ml，40g/ml，80g/ml）、棕榈酸组、棕榈酸+HZT组（80g/ml）、油酸组、油酸+HZT组（80g/ml）。将正常对照组，高糖组（33.3mmol/L），高糖+HZT组（80g/ml）；棕榈酸组(0.25mmol/L)，棕榈酸+HZT组（80g/ml），油酸组(0.25mmol/L)，油酸+HZT组（80g/ml）分别在37℃,5%CO2分别培养72h和36h，进行葡萄糖负荷试验，放射免疫法检测培养液中胰岛素水平。结果高糖+HZT组（80g/ml），棕榈酸+HZT组（80g/ml）和油酸+HZT组（80g/ml）胰岛素分泌量分别显著高于高糖组，棕榈酸组和油酸组（P<0.01），但均低于正常对照组(P<0.01)。结论降糖孜亚比提片能显著促进胰岛细胞生长和胰岛素分泌，并具有一定保护胰岛细胞功能的作用。
【关键词】胰岛胰岛素细胞培养脂肪酸葡萄糖
本实验对新疆地方中药孜亚比提片模拟在高浓度葡萄糖和高浓度游离脂肪酸环境下对体外原代培养大鼠胰岛细胞分泌胰岛素作用，研究孜亚比提片对胰岛细胞功能的影响，从而为新型抗糖尿病药物研发进行初步探索。
1材料与方法
1.1材料、试剂及仪器
1.1.1材料一周龄健康Wistar大鼠，购于新疆医科大学动物试验中心。合格证：SCXK（新2010－0001）。
1.1.2主要试剂孜亚比提片（HZT，由新疆医科大学药理教研室提供）、胶原酶Ⅱ型（CollagenaseⅡ，Gibco公司）、DMEM完全培养基（Gibco公司）、胰岛素放射免疫试剂盒（北京科美东雅）。
1.1.3主要仪器CO2培养箱、酶标仪、放射免疫γ-计数器等。
1.2方法
1.2.1大鼠胰岛细胞的制备及培养[1]将一周龄Wistar大鼠,于75%乙醇浸泡5min，无菌剖腹取出胰脏，于冰冷D-Hank’s液中漂洗，转入青霉素小瓶中，剪成0.1～0.5mm3大小的碎片，用无菌D-Hank’s液反复清洗8～10遍，加入5～10倍体积的无菌Ⅱ型胶原酶消化酶液，37℃水浴振荡消化30min后，将消化液取出移入预先准备好的离心管中，1500转10min离心，取沉淀即为消化下的细胞，加入2mlDMEM培养基，混匀即得细胞悬液，计数,调整细胞浓度为2×105个细胞/ml。
将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，接种18h后，轻轻振荡培养板，利用细胞生长差速法，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，将新培养板中的细胞继续培养48h后，用不含碘乙酸的培养基洗2次，加入培养液继续培养，每隔3d换培养液，获得单层胰岛细胞，备用。
1.2.2孜亚比提片在高浓度葡萄糖环境下对胰岛细胞胰岛素分泌量的影响[2]将原代分离细胞在低糖DMEM培养基(培养液中含5.6mmol/L葡萄糖)中培养7d－11d后形成良好单层胰岛细胞，加入胰蛋白酶短时消化，收集细胞，计数，胎盼蓝染色鉴定胰岛细胞活率，将胰岛细胞调整为2－5×105个/ml细胞悬液并分为正常对照组(培养液中含5.6mmol/L葡萄糖)，高糖组(培养液中含33.3mmol/L葡萄糖)，高糖+孜亚比提片组(20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养72h后做胰岛素释放实验。
1.2.3孜亚比提片在高浓度游离脂肪酸环境下对胰岛细胞分泌胰岛素量的影响将原代分离细胞在低糖DMEM培养基(培养液中含5.6mmol/L葡萄糖)中培养7d－11d后形成良好单层胰岛细胞，将胰岛细胞调整为2－5×105个/ml细胞悬液，并分为正常对照组(培养液中含5.6mmol/L葡萄糖)，棕榈酸组(培养液中含0.25mmol/L棕榈酸)，棕榈酸+孜亚比提片组（80μg/ml），油酸组（培养液中含0.25mmol/L油酸），油酸+孜亚比提片组（培养液中含80μg/ml孜亚比提片），37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养36h后做胰岛素释放实验。
1.3统计学处理各项数据以x-±s表示，采用ANOVA中LSD-t检验行多组间均数比较，显著性水平为0.05，使用SPSS13.0统计软件包分析。
2实验结果
2.1孜亚比提片在高浓度葡萄糖（33.3mmol/L）环境下对胰岛细胞胰岛素分泌量的影响在胰岛细胞分为正常对照组，高糖组，以及高糖+三种浓度浓度的HZT组培养基中进行72h培养后，葡萄糖负荷实验测定胰岛素释放量，数据经方差齐性levene检验，低糖刺激时，levene统计量为1.104，sig.=0.384,P>0.05，可认为方差齐。F＝395.642，sig.=0.000,P<0.01,结果表明，各实验组的胰岛素水平的差别有显著性意义，高糖+HZT(80μg/ml)组与高糖组相比差异显著（P<0.01）。高糖刺激时，levene统计量为1.913，sig.=0.129,P>0.05，可认为方差齐。F＝1056.999，sig.=0.000,P<0.01,结果表明，各实验组的胰岛素水平的差别有显著性意义。这表明，在高浓度葡萄糖环境中，HZT具有保护胰岛细胞免受高糖损伤作用，对胰岛功能具有一定保护作用。
2.2孜亚比提片在高浓度游离脂肪酸(FFAs)环境下对胰岛细胞分泌胰岛素量的影响在胰岛细胞分为正常对照组，棕榈酸组，油酸组以及棕榈酸+HZT组（80μg/ml）和油酸+HZT组（80μg/ml）培养基中进行36h培养后，葡萄糖负荷实验测定胰岛素释放量，低糖刺激时，levene统计量为1.370，sig.=0.261,P>0.05，可认为方差齐。F＝72.182，sig.=0.000,P<0.01,结果表明，各实验组的胰岛素水平的差别有显著性意义。高糖刺激时，levene统计量为1.067，sig.=0.406,P>0.05，可认为方差齐。F＝128.782，sig.=0.000,P<0.01,结果表明，各实验组的胰岛素水平的差别，在高糖刺激下棕榈酸+HZT组（80μg/ml）和油酸+HZT组（80μg/ml），胰岛素释放量都分别高于棕榈酸组和油酸组，差异显著（P<0.01），但各试验组胰岛素释放量均小于正常对照组（P<0.01）,这表明，在高浓度游离脂肪酸环境下，HZT仍然具有一定保护胰岛细胞免受游离脂肪酸损伤的作用，对胰岛功能具有一定保护作用。
3讨论
本实验从新疆地方传统治疗糖尿病药有效成分中选取了孜亚比提片作为试验药物，研究了孜亚比提片对体外原代培养大鼠胰岛细胞胰岛素分泌功能的影响。实验达到了以下目的：⑴在做孜亚比提片对大鼠胰岛细胞生长活力试验中证实了孜亚比提片具有促进胰岛细胞生长活力的作用。⑵在做模拟高浓度葡萄糖（33.3mmol/L）和高浓度游离脂肪酸环境下，孜亚比提片对胰岛细胞的功能保护试验中，证实了孜亚比提片对胰岛细胞分泌功能有一定保护作用。
参考文献
[1]胡远峰，王熠非，丁一明，等.人胰岛细胞单层培养的研究.中华器官移植杂志，1990，11：158-160.
[2]权金星，汪大望，沈飞霞，等.高浓度葡萄糖对人胰岛β细胞调亡影响的分子机制.中华老年医学杂志，2004，11：780-784.