三种甘薯病毒RNA干涉载体的构建及对甘薯的遗传转化

论文摘要

甘薯病毒病是影响甘薯产量和品质的重要因素之一,对甘薯病毒病目前尚无特别有效的化学防治方法,利用茎尖分生组织培养,培育脱毒甘薯是防治甘薯病毒病的有效方法,但也存在着病毒再次感染的问题。种植抗病毒品种是最经济有效的防治方法,但传统的抗病毒育种由于缺乏抗源材料和育种周期长等原因难以满足生产的需要。本项研究拟利用RNA干扰（RNAi）的原理,探索培育同时抗甘薯上常见的三种Potyvirus病毒的可行性。（1）根据GeneBank中登录的甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯潜隐病毒（SPLV）、甘薯G病毒（SPVG）外壳蛋白（CP）基因的核苷酸序列,分析其保守区域,各选取200 bp左右的片段,设计并合成了含有3种病毒CP基因保守区片段的融合基因SPFLG。利用分子生物学方法,将SPFLG基因以反向重复的方式分别克隆到pBlue NiRIntron载体的内含子两侧,然后将反向重复目的基因的片段插入中间载体pROK219的35S启动子的下游、NOS终止子的上游,再将包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子的目的片段,克隆到植物表达载体pBIN19上,成功构建了含有3种病毒CP基因保守区反向重复序列的RNA干涉载体pBIN-SPFLG。（2）利用农杆菌浸润法测定了RNA干涉载体pBINSPFLG对3种potyviruses病毒的干扰作用。结果表明,构建的RNA干涉载体对SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒有明显的干扰作用,农杆菌浸润后,三种病毒的含量明显减低,作用效果在浸润后15天左右最明显。（3）初步建立了“栗子香”和“北京553”两个甘薯品种的悬浮细胞培养体系,其中“栗子香”的悬浮细胞系能够得到再生植株,而北京553的悬浮细胞系未能获得再生植株。（4）利用构建的RNA干涉载体pBINSPFLG,在土壤农杆菌EHA105介导下转化甘薯品种“栗子香”,共转化外植体4000个左右,获得抗性愈伤组织120个,但未能获得再生植株。（5）利用基因枪法转化甘薯品种“栗子香”外植体2800个左右,获得了10个再生株系,其中5个株系经PCR检测为阳性。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1. 文献综述
• 1.1 甘薯及甘薯病毒病
• 1.1.1 侵染甘薯的病毒种类及危害
• 1.1.2 几种主要甘薯病毒的研究进展
• 1.1.2.1 甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）
• 1.1.2.2 甘薯潜隐病毒（SPLV）
• 1.1.2.3 甘薯G病毒（SPVG）
• 1.1.2.4 甘薯褪绿矮缩病毒（SPCSV）
• 1.1.2.5 甘薯脉花叶病毒（SPVMV）
• 1.2 甘薯的遗传转化方法
• 1.2.1 农杆菌介导法
• 1.2.2 基因枪法
• 1.2.3 电击法
• 1.3 转基因甘薯研究进展
• 1.3.1 抗病毒转基因甘薯的研究
• 1.3.2 抗虫转基因甘薯的研究
• 1.3.3 改良品质的转基因甘薯的研究
• 1.4 RNAi技术的研究进展
• 1.4.1 RNAi技术的原理
• 1.4.2 RNAi技术的应用
• 引言
• 2. 材料方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 甘薯品种
• 2.1.2 质粒及菌株
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 配制缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基本的分子生物学方法
• 2.2.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.1.2 转化大肠杆菌
• 2.2.1.3 提取质粒
• 2.2.1.4 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.1.5 转化农杆菌
• 2.2.1.6 ELISA法检测病毒含量
• 2.2.2 三种甘薯病毒RNA干涉（RNAi）载体的构建
• 2.2.2.1 目的基因的设计及合成
• 2.2.2.2 引物的设计及合成
• 2.2.2.3 RNAi载体的构建
• 2.2.3 利用农杆菌浸润法研究RNAi载体对3种病毒的抑制效果
• 2.2.3.1 配制注射缓冲液
• 2.2.3.2 农杆菌的活化
• 2.2.3.3 注射感病甘薯植株
• 2.2.3.4 ELISA法检测注射前后甘薯叶片病毒含量的变化
• 2.2.4 RNAi载体对甘薯的遗传转化
• 2.2.4.1 甘薯胚性悬浮细胞系的建立
• 2.2.4.2 农杆菌介导法转化甘薯
• 2.2.4.3 基因枪法转化甘薯
• 3. 结果与分析
• 3.1 3种甘薯病毒RNAi载体的构建
• 3.2 RNAi载体（pBIN-SPFLG）对3种病毒的抑制效果
• 3.3 甘薯胚性悬浮细胞系的建立
• 3.4 外源基因对甘薯的遗传转化及再生植株的获得
• 3.5 再生甘薯植株的PCR检测及序列测定
• 4. 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 参考文献
• Abstract