溶藻胶弧菌rpoS基因突变菌株的构建及其特性研究

论文摘要

溶藻胶弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种条件致病菌,它能感染人类和海洋动物。自然界中的细菌能够适应各种各样的不利环境,并且能在一定条件下进入活的非可培养（VBNC）状态。rpoS基因编码RpoS因子,是细菌稳定期一个调控因子,当细菌进入稳定期时,RpoS因子能够增强细胞对外界不良环境的抗逆性和适应能力。本论文目的是研究RpoS因子在溶藻胶弧菌处于恶劣环境中或诱导其进入VBNC状态过程中的作用。首先克隆了溶藻胶弧菌VIB283的rpoS基因,利用同源重组构建了该菌rpoS基因的突变菌株。通过对突变菌株和野生菌株的比较发现,在正常条件下培养,野生株和突变株都能很好的在2216E液体培养基中生长,但突变株的最终细菌浓度是野生株浓度的1/2。突变菌株对过氧化氢的应答敏感,两菌的存活率差异显著,而在高渗透压条件下,两株菌的存活率没有明显差异。将细菌寡营养条件下培养12天后,野生菌株的活菌数为原来的53.50%,突变株为原来的1.96%,两菌差异显著。在4℃寡营养条件下培养野生菌株在69天进入VBNC状态,而突变株则在37天即可进入。将野生菌株和突变菌株注射斑马鱼,检测其致病性的变化,注射的斑马鱼都有不同程度的死亡,野生菌株和突变菌株半数致死量(LD50)相似,分别是5.78×107CFU/mL和2.05×107CFU/mL,rpoS基因突变对溶藻胶弧菌致病性没有明显影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 溶藻胶弧菌致病性研究进展
• 1.1 溶藻胶弧菌简介
• 1.2 溶藻胶弧菌致病机理
• 1.2.1 毒性
• 1.2.2 粘附
• 1.2.3 毒力因子
• 2 rpoS 基因研究进展
• 2.1 rpoS 基因简介
• 2.2 复杂压力信号的整合
• 2.3 rpoS 基因的表达调控
• 2.3.1 rpoS 基因的转录调控
• 2.3.1.1 rpoS 基因启动子
• 2.3.1.2 调控rpoS 基因转录的因子
• 2.3.2 rpoS 基因翻译的调控
• 2.3.2.1 rpoS mRNA 二级结构的作用
• 2.3.2.2 调控 rpoS 基因翻译的因子
• S 因子的蛋白酶降解'>2.4 σ^S因子的蛋白酶降解
• S 因子的降解'>2.4.1 依赖于ClpXP 的σ^S因子的降解
• S 因子的降解应答调控子'>2.4.2 σ^S因子的降解应答调控子
• 3 VBNC 研究进展及溶藻胶弧菌VBNC 的概况
• 3.1 细菌VBNC 状态的生物特性
• 3.1.1 细菌在VBNC 状态下的形态
• 3.1.2 VBNC 状态下细菌的生理生化特性
• 3.2 细菌进入VBNC 状态的诱导因素
• 3.2.1 理化因素
• 3.2.2 生物因素
• 3.3 VBNC 状态下细菌的复苏
• 3.4 VBNC 状态下病原菌的致病性
• 4 本论文的研究目的意义
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂和仪器
• 1.4 溶藻胶弧菌rpoS 基因的克隆及鉴定
• 1.4.1 溶藻胶弧菌基因组DNA 的提取
• 1.4.2 引物的设计及合成
• 1.4.3 基因的PCR 扩增
• 1.4.4 扩增产物的检测及纯化
• 1.4.5 PCR 产物克隆质粒的构建及序列测定
• 1.4.6 感受态细胞的制备
• 1.4.7 重组质粒的转化
• 1.4.8 克隆质粒DNA 提取
• 1.4.9 PCR 产物克隆质粒的鉴定
• 1.5 溶藻胶弧菌rpoS 基因的表达和纯化
• 1.5.1 表达引物的设计与合成
• 1.5.2 溶藻胶弧菌rpoS 基因的PCR 扩增
• 1.5.3 pET-24d（+）/rpoS 表达质粒的构建及鉴定
• 1.5.4 rpoS 基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达
• 1.5.5 Ni 琼脂糖亲和柱亲和层析
• 1.5.6 rpoS 基因表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测
• 1.6 溶藻胶弧菌rpoS 基因突变株的构建
• 1.6.1 rpoS 基因部分同源片段的制备
• 1.6.2 rpoS 基因部分同源片段的克隆
• 1.6.3 自杀质粒的制备
• 1.6.4 重组质粒和自杀质粒pNQ705 的SalⅠ和SacⅠ双酶切和纯化
• 1.6.5 rpoS 基因同源片段与自杀质粒的连接与转化
• 1.6.6 细菌接合实验
• 1.6.7 PCR 法鉴定溶藻胶弧菌rpoS 基因突变株
• 1.7 溶藻胶弧菌rpoS 基因突变株性质研究
• 1.7.1 溶藻胶弧菌野生株和突变株生长曲线的比较
• 1.7.2 溶藻胶弧菌野生株和突变株在不同pH 条件下的生长状况
• 1.7.3 过氧化氢、高渗透压、长时期饥饿对溶藻胶弧菌突变株的影响
• 1.7.4 溶藻胶弧菌突变菌株的VNBC 状态的研究
• 1.7.5 溶藻胶弧菌突变株毒力的检测
• 1.7.6 溶藻胶弧菌野生株和突变株的几种酶活性比较
• 1.7.6.1 卵磷脂酶活性检测
• 1.7.6.2 淀粉酶活性检测
• 1.7.6.3 脂酶活性检测
• 1.7.7 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 溶藻胶弧菌rpoS 基因的克隆及分析
• 2.2 溶藻胶弧菌rpoS 基因的表达和纯化
• 2.2.1 溶藻胶弧菌rpoS 基因的构建与表达
• 2.2.2 溶藻胶弧菌RpoS 蛋白的纯化
• 2.3 溶藻胶弧菌rpoS 基因突变株的构建
• 2.3.1 rpoS 基因部分编码区的扩增
• 2.3.2 溶藻胶弧菌接合构建突变株
• 2.3.3 溶藻胶弧菌突变株的鉴定
• 2.4 溶藻胶弧菌rpoS 基因突变菌株性质分析
• 2.4.1 溶藻胶弧菌野生株和突变株生长曲线的测定
• 2.4.2 溶藻胶弧菌野生株和突变株在不同pH 条件下的生长状况
• 2.4.3 溶藻胶弧菌突变株对过氧化氢、高渗透压、长时期饥饿条件的应答
• 2.4.4 溶藻胶弧菌突变菌株诱导进入VNBC 状态
• 2.4.5 溶藻胶弧菌突变株的毒性实验
• 2.4.6 溶藻胶弧菌野生株和突变株的几种酶活性比较
• 3 讨论
• 4 小结
• 附：大菱鲆血清免疫球蛋白IgM 的纯化及应用研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 鱼类免疫球蛋白的研究现状及其进展
• 2 鱼类抗感染免疫研究进展
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与仪器
• 1.2 大菱鲆血清免疫球蛋白IgM 的纯化
• 1.2.1 大菱鲆血清制备
• 1.2.2 饱和硫酸铵分步盐析
• 1.2.3 Sepharose-4B 凝胶柱层析
• 1.2.4 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换柱层析
• 1.2.5 SDS- PAGE 电泳分析
• 1.3 兔抗大菱鲆IgM 抗血清制备及其效价检测
• 1.3.1 兔抗大菱鲆IgM 抗血清制备
• 1.3.2 琼脂扩散法检测兔血清抗体效价
• 1.3.3 酶联免疫吸附法（ELISA）检测兔抗血清效价
• 1.3.4 大菱鲆IgM 与其抗血清的斑点杂交试验
• 1.4 大菱鲆IgM 与其抗血清的Western blot 检测
• 1.5 ELISA 法检测大菱鲆接种灭活多联菌体疫苗后血清效价的变化
• 2 结果与分析
• 2.1 大菱鲆血清IgM 的纯化及其分子量的分析
• 2.2 兔抗大菱鲆IgM 抗血清效价检测
• 2.2.1 琼脂扩散法检测的效价
• 2.2.2 ELISA 法检测的效价
• 2.2.3 大菱鲆IgM 与其抗血清的斑点杂交
• 2.3 大菱鲆IgM 与其抗血清的Western blot 分析
• 2.4 用间接ELISA 方法检测免疫后大菱鲆血清特异性抗体变化
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 附录Ⅰ 溶液配方
• 附录Ⅱ 序列比对结
• 附录Ⅲ 发表和撰写的文章
• 致谢