大鼠肝再生中基因组范围内的窦内皮细胞转录谱动态分析

论文摘要

哺乳类动物肝脏在物理的（如部分肝切除、缺血/再灌注）或化学的（如CCL4）刺激后,便显示出强大的再生能力。肝脏是一种由十多种细胞构成的复杂器官,肝脏结构及其功能的恢复要依赖各种肝脏细胞体积和数量的增加,以及不同肝脏细胞或同种细胞间的相互作用。作为组成肝脏的主要非实质细胞,肝窦内皮细胞（Liver sinusoidial endithlial cells, LSEC）在肝再生启动中起重要作用。但目前在分子水平上有关肝窦内皮细胞在肝再生中作用的研究很少。因此,本论文试图通过检测窦内皮细胞的基因动态表达谱以揭示它与肝脏再生的关系。首先,我们按Higgins等描述的方法建立大鼠70%部分肝切除（Partial hepatectomy, PH）动物模型,用两步灌流和胶原酶消化法分散肝脏细胞,用Percoll密度离心与抗CD31-免疫磁珠分选相结合的方法分离纯化PH后10个不同恢复时点的再生肝窦内皮细胞。利用窦内皮细胞标志蛋白CD14和ET-1进行免疫细胞化学检测窦内皮细胞的纯度,分析显示分离的窦内皮细胞纯度在95%以上。最后用含11789个已知基因和13231个未知基因,占大鼠基因组基因85%的Rat Genome 230 2.0芯片检测了PH后10个恢复时间点大鼠再生肝窦内皮细胞的基因转录谱。为验证芯片结果的可靠性,本研究用荧光定量RT-PCR检测了再生肝窦内皮细胞中GAPDH、UBC、JUN、TTR、MYC、PCNA、APOE、TRIM24、CD14和ET-1等10个基因的表达变化情况,对肝窦内皮细胞的芯片检测结果进行分析,发现共1629个基因与肝再生相关,包括833个已知基因及796个功能未知的未知基因。K-means方法分析显示,833个已知基因大致呈现8种表达模式:即（1）肝再生启动期快速上调,PH后6 h达到表达高峰,然后快速降低,72 h时再次达到高峰;（2）肝再生增殖期显著上调,然后逐渐减弱;（3）肝再生启动期快速上调,并迂回减弱,终止期再次上调;（4）PH后逐渐上调;（5）PH后快速下调并快速恢复;（6）PH后快速下调并逐渐恢复;（7）PH后整体下调,30 h达到最低;（8）肝再生早期稍微上调后逐渐下调,终止期达到最低。基因功能分析显示,这些基因参与细胞信号转导、凝血反应、血管形成、血管收缩、细胞代谢、细胞发生、生长、增殖、分化、免疫炎症、解毒、活性物质分泌等多种生物活动。用Fisher精确检验分析这些基因功能群在8种表达模式中的富集情况,并结合通过普函数计算的基因协同效应发现,PH后短时间内,参与窦内皮细胞重要生理功能（凝血、细胞吞噬和物质运输）的基因被激活,表明肝再生早期窦内皮细胞功能有恢复的趋势;解毒相关基因在再生早期表达增强,利于肝再生中废物的清除;活性物质分泌调控活动在PH后6 h开始增强,与下游细胞因子基因表达在时间上相偶联;免疫炎症、防御应答及免疫炎症信号途径相关基因虽在再生早期减弱,但协同效应结果显示它们肝再生几乎无显著变化,很显然基因的协同效应并非是单个基因作用的简单叠加;氨基酸代谢在肝再生早期增强,在终止期减弱;糖合成相关基因在再生早期表达上调,而糖代谢基因在再生后期表达减弱,根据协同效应结果发现,肝再生早期窦内皮细胞的糖合成活动增强,终止阶段无论糖合成还是糖酵解活动均减弱。另外,细胞增殖相关基因的表达在部分肝切除术30 h后恢复,这有利于肝再生中肝窦内皮细胞增殖。总之,肝再生中基因功能群富集和基因协同作用相结合的分析方法将助于揭示窦内皮细胞与大鼠肝再生的相关性。为探讨796个未知基因在肝再生中作用,本研究首先通过电子克隆预测它们编码的氨基酸序列,发现其中486个未知基因具有相应的氨基酸序列。根据本实验室建立的大鼠蛋白质亚细胞定位方法进行预测,发现大部分基因编码产物定位在细胞外基质、细胞质膜和细胞核中,表明它们可能参与组织结构重建、细胞膜形成和基因转录调控等活动。总之,上述预测结果为下一步实验研究其功能提供了有价值的参考。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 肝脏
• 1.1 肝脏的结构
• 1.2 肝脏的功能
• 2 肝再生
• 2.1 肝再生动物模型
• 2.2 肝再生进程及调控
• 2.3 肝再生中肝脏细胞间相互作用关系
• 3 肝窦内皮细胞与肝再生
• 4 肝窦内皮细胞
• 4.1 肝窦内皮细胞的结构
• 4.2 肝窦内皮细胞的异质性
• 4.3 肝窦内皮细胞的标志物
• 4.4 肝窦内皮细胞表面的特异受体
• 4.5 肝窦内皮细胞的功能
• 5 肝窦内皮细胞的分离和纯化
• 6 高通量基因表达谱检测
• 参考文献
• 第二部分 大鼠肝再生中肝窦内皮细胞的基因表达谱分析
• 引言
• 第一章 材料与方法
• 1 实验动物与分组
• 2 大鼠2/3 肝切除模型制备
• 2.1 实验用品
• 2.2 操作步骤
• 3 大鼠肝脏细胞的分散
• 3.1 实验用品
• 3.2 试剂配制
• 3.3 操作步骤
• 4 肝窦内皮细胞的分离和纯化
• 4.1 实验用品
• 4.2 试剂配制
• 4.3 操作步骤
• 5 肝窦内皮细胞的鉴定
• 5.1 免疫细胞化学检测
• 5.2 免疫组织化学检测
• 5.3 Western blot 检测
• 6 总RNA 的提取与纯化
• 6.1 总RNA 的提取
• 6.2 RNA 质量检测
• 6.3 总RNA 的纯化
• 6.4 纯化的总RNA 质量检测
• 7 cDNA、cRNA 的合成与纯化
• 7.1 cDNA 的合成与纯化
• 7.2 cRNA 的合成与纯化
• 8 cRNA 片段化和Rat Genome 230 2.0 芯片检测
• 8.1 cRNA 片段化
• 8.2 杂交液的配制
• 8.3 芯片预杂交和杂交
• 8.4 芯片洗脱
• 8.5 芯片扫描
• 8.6 芯片检测数据的获取、预处理、均一化及数据转换
• 8.7 芯片检测数据的校正
• 9 荧光定量RT-PCR 检测芯片结果的可靠性
• 9.1 引物的设计与合成
• 9.2 标准曲线的建立
• 9.3 定量PCR 检测
• 9.4 定量分析
• 10 基因芯片数据分析
• 10.1 大鼠再生肝窦内皮细胞中肝再生相关基因的确认
• 10.2 基因的聚类分析
• 10.3 基因的表达模式分析
• 11 基因功能注释及统计学分析
• 12 基因协同作用分析
• 13 大鼠未知基因编码产物的亚细胞定位预测
• 13.1 未知基因电子克隆
• 13.2 大鼠蛋白亚细胞定位方法的建立
• 13.3 预测未知基因编码产物的亚细胞定位
• 第二章 研究结果
• 1 大鼠肝再生中肝系数变化
• 2 大鼠肝再生中肝窦内皮细胞形态结构变化
• 3 大鼠肝再生中肝窦内皮细胞数量变化
• 4 大鼠肝再生中窦内皮细胞的标志蛋白及其mRNA 的含量变化
• 5 大鼠肝再生中肝窦内皮细胞基因转录表达谱概述
• 6 荧光定量RT-PCR 检测结果与Rat Genome 230 2.0 芯片结果比较
• 7 大鼠再生肝窦内皮细胞中肝再生相关的已知基因的表达谱分析
• 7.1 基因的表达模式分析
• 7.2 基因功能注释
• 7.3 八种表达模式中基因功能群的富集分析
• 7.4 显著富集的功能群在大鼠部分肝切除后窦内皮细胞中的活动变化
• 7.5 凝血反应相关基因的转录谱变化
• 7.6 肝窦内皮细胞重要的生理功能---吞噬作用和运输相关基因的转录谱变化
• 7.7 解毒作用相关基因的差异表达调控
• 7.8 活性物质分泌调控相关基因的转录谱变化
• 7.9 防御应答、免疫炎症及免疫炎症信号途径相关基因的转录谱变化
• 7.10 细胞信号转导相关基因的转录谱变化
• 7.11 氨基酸代谢和糖代谢相关基因的差异表达调控
• 7.12 蛋白质代谢相关基因的转录谱变化
• 7.13 细胞生长增殖相关基因的转录谱变化
• 7.14 细胞分化相关基因的转录谱变化
• 7.15 细胞凋亡相关基因的转录谱变化
• 8 大鼠肝窦内皮细胞中肝再生相关未知基因的功能预测
• 8.1 大鼠蛋白亚细胞定位预测数据库构建
• 8.2 未知基因亚细胞定位预测结果
• 第三章 讨论
• 参考文献
• 第三部分 结论
• 附录 1 英文缩略语
• 附录 2 主要实验仪器
• 个人简介
• 在攻读博士学位期间参加的科研项目和发表的论文
• 致谢