论文摘要
冷胁迫是限制农作物产量、质量、收获后保存期的重要的环境胁迫之一。全球每年因为低温造成的经济损失达到上千亿美元，如何减少低温所造成的经济损失已成为世界性的问题。许多温带植物，包括模式植物拟南芥，都显示出响应低温非冻温的状况下出现抗寒性的提高的现象，这种现象被称为冷驯化。在长期的植物逆境胁迫响应研究中发现，CBF途径在低温响应中占主要地位。其中的主要元件——胞嘧啶重复／脱水响应元件结合因子（C-repeat／dehydration responsive binding factor），由DREB1／CBF基因家族编码。CBF基因在高等植物中广泛存在，DREB1／CBF转录因子在冷胁迫响应中起“总开关”的作用，受其诱导的靶基因约占冷胁迫下所有上调基因的90％。DREB1／CBF转录因子在冷刺激下迅速大量表达，通过结合在大多数胁迫响应基因启动子的CRT／DRE元件上，诱导大量参与胁迫响应的基因表达，从而综合提高植物的抗寒性、抗旱性和抗盐碱性，已经在水稻、玉米、番茄等多个物种中得到证实。现目前植物抗寒研究的对象多是以拟南芥为首的热温带植物，为得到更优秀的抗寒基因，选择和拟南芥同属十字花科耐寒植物播娘蒿（Descurainia sophia）作为实验材料。它来自于高原，具有极强的适应恶劣环境的能力，在零下6℃下仍然能正常生长。在本实验室先前的生理研究证明其抗寒性和克隆得到播娘蒿CBF1基因的ORF序列的基础上，针对DsCBF基因的本身性能及其调控机制进行研究，为进一步从分子水平上解释耐寒植物与不耐寒植物之间的不同，填补了耐寒植物的抗寒机制研究的空白打下了基础，对进一步探索植物的抗逆机制和培育优良的抗寒经济作物有重要的意义，开展研究得到以下成果：一、克隆DsCBF1基因cDNA全长及DsCBF2基因EST。通过CLONTECH的5’RACE的方法得到播娘蒿DsCBF1基因的cDNA全长序列946bp；并结合其他物种的CBF基因序列进行比对，根据其同源保守区设计简并引物，利用同源克隆得到播娘蒿第二条CBF基因640bp大小的EST序列暂时命名为DsCBF2。二、生物信息学分析证明所得的DsCBF基因序列属于CBF基因家族。通过分析，得到正确完整的CBF1基因ORF框642bp，对两条播娘蒿的CBF基因进行核酸序列比对，它们之间具有非常高的同源性，而且其N端的同源性明显高于C端，推测它们在分子进化中可能是由一条基因产生。将DsCBF1基因所推演出的蛋白质序列和已知物种的DREB1／CBF蛋白比较，发现它具有DREB1／CBF转录因子的典型特征。通过构建多个物种进化树发现，DsCBF1与AtCBF3亲缘关系更近，推测其功能与表达机制和AtCBF1～3相似。三、研究DsCBF基因在冷胁迫下的mRNA转录水平差异，证明它们的确受冷胁迫诱导表达。采用荧光定量PCR的方法，对播娘蒿的两条CBF基因进行冷胁迫下的差异表达研究。实验结果表明：在持续的冷胁迫下，DsCBF1和DsCBF2都被快速诱导，二者的mRNA水平有明显差异，且在转录上存在时间和空间的差异，这可能预示了二者在抗寒机制中的优秀协同作用。在常温下，DsCBF1和DsCBF2基本上没有表达，而且DsCBF1在在温度下降至10℃时，转录水平才有较大的增长。随温度的越低，检测到DsCBF的mRNA水平越高；在低温处理2h后回复22℃处理30min，其mRNA水平明显快速下降，这显示出CBF基因在植物对抗冷胁迫的途径中的快速的调控机制。该研究内容为今后开展播娘蒿DsCBF基因家族的功能研究奠定了基础。四、建立花序转染转基因体系，获得DsCBF1转基因拟南芥功能验证体系。根据播娘蒿的DsCBF1基因的ORF序列设计引物，克隆得到该基因的ORF全长，构建到植物双元表达载体中，通过农杆菌介导的花序浸染法，将其转入野生型拟南芥中，为今后的进一步筛选以及研究DsCBF1的体内功能奠定了基础。
论文目录
相关论文文献
- [1].盐地碱蓬2个DREB1/CBF基因的克隆与表达调控分析[J]. 中国农业科学 2016(12)