论文摘要
第一部分高糖、高游离脂肪酸和低氧刺激对Hcdc 14A和相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响目的：观察高糖、高游离脂肪酸（FFA）和低氧刺激对人脑血管内皮细胞Hcdc14A和相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。方法：分别采用不同条件的高糖、高FFA和低氧刺激人脑血管内皮细胞：RT-PCR和Western-blot检测Hcdc14A的mRNA和蛋白表达；Western-blot检测相关周期蛋白cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达；XTT法和CCK8法测定细胞增殖率和存活率；流式细胞术和caspase3活性检测法观察细胞凋亡；流式细胞术观察细胞周期；荧光探针观察细胞骨架蛋白F-actin空间结构；电镜观察细胞超微结构。结果：1．高糖、高FFA和低氧刺激均可明显下调人脑血管内皮细胞Hcdc14A的mRNA和蛋白表达。2．高糖、高FFA和低氧刺激均可下调cyclinB、cyclinD和cyclinE蛋白表达，上调P53蛋白表达。3．高糖、高FFA和低氧刺激均使细胞增殖率和存活率下降。4．高糖、高FFA和低氧刺激均使细胞凋亡率增加，Caspase-3活性增强。5．高糖、高FFA和低氧刺激均明显下调细胞周期中S期和G2-M比例。6．高糖、高FFA和低氧刺激均对细胞骨架蛋白F-actin空间结构产生一定影响。7．电镜观察发现高糖、高FFA和低氧刺激后凋亡细胞增多，联合刺激组凋亡小体形成较明显。结论：高糖、高FFA和低氧刺激均可明显下调人脑血管内皮细胞Hcdc 14A和相关周期蛋白表达，阻滞细胞周期，降低细胞增殖率，诱导细胞凋亡，并对细胞骨架蛋白F-actin空间结构和细胞超微结构产生一定影响，三者联合刺激上述作用最为明显。第二部分过表达Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响目的：观察过表达Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。方法：构建Hcdc14A真核表达载体并转染HEK293细胞和Hela细胞；共聚焦显微镜观察Hcdc14A在细胞分裂期的定位；Western-blot检测重组质粒转染后Hcdc14A表达效率及其过表达对cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达的影响；CCK8方法检测重组质粒转染并给予高糖、高FFA和低氧联合刺激后的细胞存活率；流式细胞术和caspase3活性测定法观察转染和联合刺激后的细胞凋亡；流式细胞术观察转染和联合刺激后的细胞周期；荧光探针观察转染和联合刺激后细胞骨架蛋白F-actin空间结构；电镜观察转染和联合刺激后的细胞超微结构。结果：1．成功构建并转染Hcdc14A真核表达载体（pEGFP-C2-Hcdc14A质粒），重组质粒转染后Hcdc 14A表达显著上调，发现其在细胞分裂期定位于纺锤体两极和中心体上。2．重组质粒转染后Hcdc14A表达显著上调，同时cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达均不同程度上调。3．转染后细胞增殖率明显增加。4．转染后caspase3活性有所增强。5．转染后细胞周期S期和G2-M比例明显增加。6．转染后细胞骨架蛋白F-actin出现解聚样改变。7．电镜观察发现转染后少部分细胞呈现肿瘤化改变。结论：过表达Hcdc14A可同时上调cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达，加速细胞周期进程，提高细胞增殖率，促进细胞骨架蛋白F-actin解聚，同时也可能影响细胞凋亡进程。提示过表达Hcdc14A可同时影响相关周期蛋白表达和细胞周期进程，进而影响细胞的增殖和凋亡进程。第三部分siRNA干扰Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响目的：观察siRNA干扰Hcdc14A基因表达对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。方法：设计合成3对靶向Hcdc14A特定序列的siRNA并转染细胞：RT-PCR和Western-blot验证Hcdc14A表达；Western-blot检测siRNA干扰对cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达的影响；CCK8方法检测siRNA干扰后的细胞存活率；caspase2活性测定法观察siRNA干扰后的细胞凋亡；流式细胞术观察siRNA干扰后的细胞周期；荧光探针观察siRNA干扰后的细胞骨架蛋白F-actin空间结构；电镜观察siRNA干扰后的细胞超微结构。结果：1．siRNA能显著下调Hcdc14A的mRNA和蛋白表达水平。2．siRNA干扰还可同时下调cyclinB和cyclinD蛋白表达，上调P53蛋白表达，对cyclinE无明显影响。3．siRNA干扰后细胞存活率明显下降。4．siRNA干扰后细胞凋亡明显增加。5．siRNA干扰后细胞周期中S期和G2-M比例明显减少。6．siRNA干扰后细胞骨架蛋白F-actin呈现一定聚合样改变。7．电镜观察发现siRNA干扰后凋亡细胞增多。结论：siRNA干扰Hcdc14A基因表达的同时还可影响相关周期蛋白cyclinB、cyclinD和P53的表达，阻滞细胞周期进程，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并可能对骨架蛋白F-actin空间结构产生一定影响。提示下调Hcdc14A基因表达可能引起整个细胞周期调控网络功能紊乱，导致细胞正常生理功能发生改变。第四部分G-CSF对Hcdc14A和相关周期蛋白表达的影响及其细胞保护作用机制目的：观察G-CSF对人脑血管内皮细胞Hcdc14A和相关周期蛋白表达的影响，初步探讨G-CSF对联合刺激后人脑血管内皮细胞的保护作用及其机制。方法：不同条件G-CSF刺激人脑血管内皮细胞，CCK8法和caspase3活性测定法观察G-CSF对细胞增殖和凋亡的影响；XTT法和CCK8法检测G-CSF预处理不同时间对高糖、高FFA和低氧联合刺激后细胞增殖率和存活率的影响；Western-blot检测G-CSF预处理对Hcdc14A及相关周期蛋白表达的影响；流式细胞术和caspase3活性测定法观察G-CSF预处理对细胞凋亡的影响；流式细胞术检测G-CSF预处理对细胞周期的影响；荧光探针观察G-CSF预处理对细胞骨架蛋白F-actin空间结构的影响：电镜观察G-CSF预处理对细胞形态学的影响；荧光探针检测G-CSF预处理对活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）、钙离子(Ca2+)及线粒体膜电位（MMP）等氧化应激相关指标的影响；ELISA和免疫荧光等方法检测G-CSF预处理对PI3K／AKT和MAPK信号通路的影响。结果：1．G-CSF刺激可促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。2．G-CSF预处理12h可明显提高联合刺激后的细胞增殖率和存活率。3．G-CSF能够明显上调Hcdc14A、cyclinB和cyelinE蛋白表达，下调P53蛋白表达，对cyclinD无明显影响。4．G-CSF预处理可明显抑制联合刺激诱导的细胞凋亡。5．G-CSF预处理可上调S期和G2-M期细胞比例。6．G-CSF预处理可促进细胞骨架蛋白F-actin解聚。7．电镜观察发现G-CSF预处理后凋亡细胞有所减少。8．G-CSF预处理可明显拮抗联合刺激诱导的氧化应激，上调NO、eNOS和MMP水平，降低ROS和Ca2+水平。9．G-CSF可激活PI3K／AKT和ERK1／2信号通路，并抑制JNK和p38信号通路。结论：G-CSF能够上调Hcdc14A和相关周期蛋白cyclinB、cyclinE蛋白表达，下调P53蛋白表达，调控细胞周期进程，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，拮抗高糖、高FFA和低氧联合刺激诱导的氧化应激，并可激活PI3K／AKT和ERK1／2信号通路，抑制JNK和p38信号通路。提示G-CSF可能是通过调控Hcdc14A和相关周期蛋白表达、拮抗氧化应激、影响PI3K／AKT和MAPK信号通路等多种机制发挥其内皮细胞保护作用。
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