MMP-9在EAE大鼠脊髓中的动态变化及普罗布考的干预作用

论文摘要

目的：多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种中枢神经系统慢性炎症性脱髓鞘疾病，它的典型病理特征是炎性细胞浸润、髓鞘脱失、轴索变性以及胶质细胞增生等。目前许多研究表明多发性硬化早期即存在血脑屏障破坏，并推测其可能是多发性硬化发病的关键环节之一。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）被公认为是MS的理想模型。其临床表现及病理改变与多发性硬化极为相似，为研究MS免疫病理学机制及其实验治疗的最佳动物模型。基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinases-9，MMP-9）是一类是锌离子依赖的蛋白酶，具有破坏血脑屏障，降解细胞外基质、髓鞘碱性蛋白的作用,可以导致血管内皮细胞通透性增高，进而导致T淋巴细胞等炎症细胞穿透血管基底膜进入中枢神经系统。MS血脑屏障的破坏、炎性细胞浸润、髓鞘降解以及轴索的损伤等主要病理过程均与MMPs活性异常增高有关，推测MMPs参与了MS的发病，但其具体机制尚不清楚。以前我们认为Th1介导了MS的发生，但是近年来随着对Th17细胞的深入研究人们发现IL-23/IL-17炎症轴对MS起更重要的作用，IL-17是Th17细胞产生的一种强力致炎因子，与MS关系密切。研究发现氧化应激在MS发病过程中起重要的作用，普罗布考是一种降脂药物，但同时又具有强力的抗炎、抗氧化、清除自由基等作用，可通过抗炎、减轻氧化应激反应、清除自由基等作用而减轻细胞的损伤。近年来研究发现普罗布考可用于多种疾病的治疗，但是普罗布考用于多发性硬化的研究很少，普罗布考能否通过它的抗炎、抗氧化、清除自由基等作用,调节MMP-9、IL-17表达减轻EAE大鼠中枢神经系统损伤？目前研究甚少。本研究通过普罗布考对EAE大鼠的干预来动态观察血脑屏障损伤和血清炎症相关指标的变化，了解其是否对EAE有保护作用，从而为临床治疗MS提供新的思路和实验依据，并且可直接应用于临床。通过对相关指标的测定、分析，进一步了解MS的发病机制方法：1实验分组及干预措施选取Wistar大鼠120只，雌性,6-8周龄,体重180～220g,随机分为四组，每组30只。对照组，用生理盐水加CFA注射动物。EAE组，以小剂量豚鼠全脊髓匀浆及含有卡介苗的CFA免疫动物,建立EAE模型。普罗布考-EAE组，以小剂量豚鼠全脊髓匀浆及含有卡介苗的CFA免疫动物,建立EAE模型,免疫当天开始给予普罗布考（500mg/kg·d）灌胃，直至处死。泼尼松+EAE组，以小剂量豚鼠全脊髓匀浆及含有卡介苗的CFA免疫动物,建立EAE模型,免疫当天开始给予泼尼松（5mg/kg·d）灌胃，直至处死。四组动物每组按免疫后0,3,7,10,14,21天6个时间点分为6个亚组。2动物模型的建立豚鼠麻醉，冰上取脊髓全长，仔细去脊髓包膜并称重，加入10倍量冰盐水，制成豚鼠脊髓匀浆（GPSCH），再加入等体积含6mg/mL卡介苗的完全福氏佐剂（CFA），冰上抽打制成油包水乳剂,为完全免疫抗原。按0.5ml/只分别于大鼠四肢足垫及背部皮下注射抗原匀浆，建立EAE动物模型。3临床评分免疫后，观察动物精神反应状态、体重及活动等情况变化，并进行神经功能评分。评分采用国际通用的Kono评分标准。4检测指标取腰膨大组织制做石蜡包块，行HE染色，用免疫组织化学法测定脊髓腰膨大中MMP-9的表达。ELISA试剂盒检测血清IL-17含量。结果:1发病情况：（Fig1）（Table2）大鼠在抗原免疫诱导后逐渐出现精神萎靡，食欲不振，体重减轻，皮毛不光滑等情况，并逐渐出现尾部无力、后肢无力、前肢无力甚至大小便失禁等临床症状，大鼠发病临床表现呈动态性变化，普罗布考-EAE组、醋酸泼尼松-EAE组大鼠发病时间，病情高峰期均推迟，症状较EAE组轻。2神经功能评分：（Table1）普罗布考-EAE组大鼠免疫后第14天神经功能评分低于EAE组，具有统计学意义（P<0.05）。醋酸泼尼松-EAE组大鼠免疫后第14天神经功能评分低于EAE组，具有统计学意义（P<0.05）。普罗布考-EAE组、醋酸泼尼松-EAE组免疫后第14天神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）。3组织病理学改变：（Fig2-5）EAE组7天组、10天组、14天组、21天组大鼠脊髓均可见不同程度的炎性细胞浸润，尤以14天组大鼠脊髓内炎性细胞浸润的程度最为显著，血管周围出现密集的袖套样炎性细胞浸润。普罗布考-EAE组、醋酸泼尼松-EAE组不同时间大鼠脊髓病理改变有不同程度的减轻。4免疫组化结果：（Fig6-10）（Table3）4.1EAE组和对照组两组比较EAE组3天组、7天组、10天组、14天组、21天大鼠脊髓中MMP-9阳性细胞数显著高于同期对照组，具有统计学意义（P<0.05）。4.2EAE组内比较EAE组14天组与0天组、3天组、7天组、10天组、21天组相比较，大鼠脊髓腰膨大处MMP-9阳性细胞数目较多，且具有统计学意义（P<0.05）；EAE组7天组与10天组相比较，10天组与21天组比较均不具有统计学意义（P>0.05）；EAE组其余各组间相互比较，均具有统计学意义（P<0.05）。4.3EAE组、普罗布考-EAE组、醋酸泼尼松-EAE组三组比较普罗布考-EAE组、醋酸泼尼松-EAE组与EAE组在7天、10天、14天、21天，比较大鼠脊髓腰膨大处MMP-9阳性细胞数目明显减少，具有统计学意义（P<0.05）；普罗布考-EAE组与醋酸泼尼松-EAE组0天、3天、7天、10天、14天、21天比较大鼠脊髓腰膨大处MMP-9阳性细胞数目均不具有统计学意义（P>0.05）；普罗布考-EAE3天组与EAE3天组比较大鼠脊髓腰膨大处MMP-9阳性细胞数目不具有统计学意义（P>0.05）。5血清中IL-17含量比较（Fig11）（Table4）5.1EAE组和CFA组两组比较EAE组7天组、10天组、14天组、21天大鼠血清中IL-17的含量比较高于同期对照组，具有统计学意义（P<0.05）。5.2EAE组内比较EAE7天组与10天组，0天组与3天组比较大鼠血清中IL-17的含量差异没有统计学差异（p>0.05）；其他各组比较差异有统计学差异（p<0.05）。5.3EAE组、普罗布考-EAE组、醋酸泼尼松-EAE组三组比较普罗布考-EAE组、醋酸泼尼松-EAE组与EAE组在7天、10天、14天、21天比较大鼠血清中IL-17的含量明显减少，具有统计学意义（P<0.05）；普罗布考-EAE组与醋酸泼尼松-EAE组0天、3天、7天、10天、14天、21天比较大鼠血清中IL-17的含量均不具有统计学意义（P>0.05）。结论：1EAE大鼠脊髓腰膨大MMP-9表达，血清IL-17水平与疾病活动有关。2普罗布考可以推迟EAE大鼠的发病时间，减轻疾病对神经系统功能损害。3普罗布考能够减轻EAE大鼠脊髓腰膨大炎性细胞浸润程度。4普罗布考能够降低EAE大鼠脊髓MMP-9表达，降低EAE大鼠血清IL-17水平，提示其在治疗人类MS方面具有很有希望的应用前景。5普罗布考与醋酸泼尼松比较，虽然醋酸泼尼松在推迟发病时间上优于普罗布考，但是普罗布考可避免长期应用醋酸泼尼松引起的严重不良反应，充分显示出应用安全、耐受性良好的优势。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 多发性硬化与血脑屏障
• 参考文献
• 致谢
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