甘蓝型油菜BnPPT1基因的克隆及其功能研究

论文摘要

磷酸烯醇式丙酮酸／磷酸转运子基因（Phosphoenolpyruvate/phosphate translocator 1,PPT1）是细胞质体碳水化合物转运的一个关键基因,在植物莽草酸代谢和脂肪酸生物合成途径中起着重要作用。根据模式植物拟南芥PEP转运子AtPPT1基因序列与油菜数据库BBSRC BrassicaDB中相应ESTs设计全长引物,以甘蓝型油菜（Brassica napus）幼嫩叶片基因组DNA和种子cDNA为模板,克隆甘蓝型油菜PEP转运子基因全长序列,命名为BnPPT1.该基因gDNA全长为2075bp,含有8个内含子,编码区长度为1224bp,编码407个氨基酸。序列比对表明,BnPPT1与同属于十字花科拟南芥AtPPT1转运子同源性很高,仅有个别氨基酸的差异；进化分析结果进一步说明两者近亲缘关系。以BnPPT1全长cDNA为目标序列,构建组成性强启动子CamV35S驱动的与报告基因eGFP融合的植物表达载体BPE,同时以一401bp的BnPPT1片断为靶片断,构建CamV35S启动子驱动的RNAi载体BPTi,通过花粉管浸泡法导入到拟南芥,进行融合蛋白亚细胞定位观察以及功能表达验证；亚细胞定位分析结果表明BnPPT1基因编码蛋白与ATPPT1蛋白一样定位于细胞质体,且以BnPPT1基因部分cDNA片断构建的RNAi载体BPTi的转基因拟南芥表现出内源基因AtPPT1的表达抑制,出现了明显的低叶绿素表型,而BPE转基因能完全恢复AtPPT1基因功能缺失拟南芥突变体表型。这些研究结果不仅说明了BnPPT1基因与拟南芥AtPPT1基因高度同源,同时也表明两者可能具有相同的生物学功能,由此推测在甘蓝型油菜中,BnPPT1基因具有提供油脂／蛋白质生物合成的重要底物PEP这一十分重要的生物学作用。采用半定量RT-PCR分析表明,BnPPT1基因在油菜各器官中表达差异很大,在幼嫩的子叶、茎以及中早期发育时期种子中有较高丰度的表达,在种子中表达丰度随发育时期逐步升高,但在成熟后期没有表达,暗示该基因在油菜籽粒油份等物质积累中有重要功能。因此,通过农杆菌转染油菜下胚轴的技术,将构建好的BPE载体导入了本研究室前期获得高油份甘蓝型油菜中,PCR检测以及除草剂抗性筛选表明成功获得了转基因阳性株系32份；T0代单株套袋成熟种子油份以及脂肪酸成分的测定结果表明转基因T0代植株油份分布出现类似正态分布的趋势,与转基因阴性对照相比,脂肪酸组分没有明显变化,而油份含量有所增高,最高增加了10.5个百分点。这些T0代植株出现类似正态分布的油份分布趋势说明,目标基因在不同转基因油菜中基因表达差异明显,个体性状分化较大,为进一步明确目标转基因的功能,并为转基因材料提供可靠的分子身份,本论文综合反向PCR法在其它物种上的成功报道,对反向PCR法的几个关键条件进行了优化,成功分离克隆了1份高油转基因油菜外源T-DNA的侧翼序列。这些结果为进一步深入研究和应用BnPPT1基因在提高油菜籽粒含油量奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 油菜种子油脂合成的生化基础
• 1.1.1 关键酶活性对油脂合成过程的影响
• 1.1.2 关键代谢物质对油脂合成过程的影响
• 1.1.3 关于油脂合途径的代谢调控研究
• 1.2 基因工程技术在提高油菜含油量上的应用
• 1.2.1 转基因手段
• 1.2.2 反义RNA技术
• 1.3 PPT蛋白研究现状
• 1.3.1 质体内膜上的转运蛋白的种类
• 1.3.2 PPT转运蛋白的功能研究
• 1.3.3 拟南芥中PPT基因的研究进展
• 1.4 侧翼序列克隆技术研究进展
• 1.4.1 反向PCR技术
• 1.4.2 热不对称交错PCR（TAIL-PCR）
• 1.4.3 外源接头PCR
• 1.4.4 质粒拯救法
• 2 甘蓝型油菜PEP转运蛋白BnPPT1基因的克隆及功能证
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 生物材料
• 2.1.2 酶和其他化学试剂
• 2.2 主要方法
• 2.2.1 BnPPT1基因的克隆
• 2.2.2 BnPPT1序列分析、比对和进化树
• 2.2.3 BnPPT1蛋白的亚细胞定位
• 2.2.4 BnPPT1基因RNAi载体转化拟南芥
• 2.2.5 过表达BnPPT1转化拟南芥同源基因AtPPT1基因缺失突变体
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 BnPPT1基因的克隆和序列分析
• 2.3.2 BnPPT1蛋白序列比对及进化分析
• 2.3.3 BnPPT1蛋白的亚细胞定位
• 2.3.4 BnPPT1能有效干涉同源AtPPT1基因的表达
• 2.3.5 BnPPT1过表达能回复拟南芥AtPPT1基因缺失突变体
• 2.4 讨论
• 3 甘蓝型油菜BnPPT1基因的遗传分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 生物材料
• 3.1.2 质粒和菌株
• 3.1.3 酶和试剂
• 3.2 主要方法
• 3.2.1 BnPPT1基因组织表达分析
• 3.2.2 油菜遗传转化
• 3.2.3 转化植株的筛选鉴定
• 3.2.4 含油量及脂肪酸成分的测定
• 3.2.5 优化方法克隆高油材料侧翼序列
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 BnPPT1基因的组织表达模式
• 3.3.2 过表达BnPPT1转基因甘蓝型油菜的获得
• 3.3.3 抗性检测及分子验证
• 3.3.4 籽粒含油量及脂肪酸成分分析
• 3.3.5 优化IPCR法能有效分离外源T-DNA侧翼序列
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录