大鼠骨髓基质干细胞向心肌细胞的诱导分化与移植治疗心肌梗死的实验研究

论文摘要

研究背景与目的：急性心肌梗死是一种常见的、多发的心脏疾病,因其死亡率高及心力衰竭等并发症而严重威胁着人类的健康。传统的治疗方法仅能减缓或改善心肌梗死的病程,不能使已坏死的心肌细胞再生。近年来,许多动物实验和临床前期试验证实,细胞移植治疗法可增加有功能的心肌细胞的数量,改善心脏功能。干细胞中的骨髓基质干细胞（Bone Marrow stromal stem cells, BMSCs）,由于其取材方便、可以体外培养增殖、免疫排斥反应小和无伦理道德问题等优点,正在成为组织工程细胞移植术中理想的种子细胞。本实验旨在探讨体外分离培养BMSCs的方法、BMSCs的定向诱导分化及移植治疗MI的细胞学机制,为临床应用提供理论依据。研究内容和方法：（1） BMSCs（?）勺体外分离培养与鉴定：以冲洗法获得4周龄Wistar大鼠胃髓；并以1×107个/ml接种于细胞培养瓶,24小时后首次换液,当细胞铺满培养瓶底80～90%时,再以2×10个/ml的密度进行传代培养。用流式细胞仪检测第3代细胞表面抗原CD29、CD34、CD90（?）勺表达情况对BMSCs进行鉴定。（2）BMSCs体外定向诱导及诱导细胞的鉴定：以5-aza对培养48小时的第3代BMSCs进行诱导,设1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L诱导浓度,24h换液去除诱导剂。取10μmol/L诱导后培养14、21天的细胞,采用细胞免疫化学检测横纹肌肌动蛋白Actin和缝隙连接蛋白43的表达情况。（3）大鼠心肌梗死模型（cute myocardial infarction, MI）的建立：采用开胸结扎左冠状动脉前降支法制作MI大鼠模型,并以心电图、组织切片、TTC染色和心脏外观的变化评价MI模型。（4）移植细胞的标记及MI大鼠心肌内细胞移植：以50μg/ml DAPI标记第3代BMSCs,并调整细胞密度为1×107个/50μL,1小时内将细胞注射入大鼠心肌梗死部位。（5）移植细胞存活与分化的检测及初步治疗效果的观察：在荧光显微镜下观察免疫荧光染色的组织切片,判断是否存在同时发蓝色荧光和红色荧光的细胞。通过心电图检测,组织切片观察及毛细血管密度变化评价细胞移植治疗效果。结果：（1）原代培养24小时后即可见少量的圆形细胞贴壁,后逐渐生长呈长梭形纤维样细胞,有集落形成,12天左右第一次传代。传代培养时刚贴壁的细胞呈圆形,很快伸展为短梭形、长梭形及不规则多边形。传代培养的细胞生长曲线近似“S”形,迅速增值时间3-5天,第7天进入平台期。流式细胞术的检测结果是CD29、CD34和CD90的阳性表达率分别为84.8%、3.2%和95.3%（2）比较诱导结果得出最适诱导浓度为10μmol/L,此浓度诱导的细胞形态类似于心肌样细胞。细胞免疫化学显示,诱导细胞阳性表达Actin和CX43。说明诱导后的BMSCs定向分化为心肌样细胞（3）AMI大鼠模型评价：实验组大鼠与对照组大鼠的心电图相比,出现Q波异常和／或ST段抬高（0.2-0.4mV）和／或T波倒置。另外,MI大鼠心肌组织切片观察到：心肌细胞基本结构紊乱,核固缩且染色加深,有的核甚至溶解消失。TTC染色显示梗死部位显白色,正常组织呈深红色。证明了MI模型的制作成功,成功率为65.51%。（4）细胞移植对MI大鼠的治疗效果初步评价：细胞移植3周后心电图检测显示基本恢复正常。HE染色的组织切片中存在核浆比例较大、生长排列方向与肌纤维一致的细胞。实验组中毛细血管密度大于对照组,改善了心脏的供血功能。细胞移植大鼠的组织切片免疫荧光检测,发现存在既发蓝色荧光又发红色荧光的细胞,说明移植的BMSCs在梗死部位存活并定向分化为心肌细胞。结论：大鼠BMSCs适宜体外分离培养、扩增和诱导分化；5-aza诱导BMSCs定向分化为心肌样细胞,表达心肌蛋白Actin和CX43；结扎左冠状动脉前降支可建立稳定的心肌梗死模型；BMSCs移植3周后存活于心肌梗死部位并定向分化为心肌样细胞,改善了大鼠的心脏功能。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 文献综述
• 1 干细胞的来源及其作用
• 2 骨髓基质干细胞的分离、体外培养与鉴定
• 3 骨髓基质干细胞的生物学特性和表型特征
• 4 骨髓基质干细胞的诱导分化及应用
• 5 细胞移植治疗心肌梗死的研究
• 6 细胞移植治疗心肌梗死存在的问题及展望
• 参考文献
• 第一部分 大鼠骨髓基质干细胞的分离培养、鉴定及向心肌细胞的定向诱导分化
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 骨髓基质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的初步研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录