非B细胞来源Igκ保守序列特异性抗体应用的初步研究

论文摘要

免疫球蛋白（Ig）是由B淋巴细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所分泌的,其两种表现形式是分泌型与膜型。前者可以抗体形式存在与体液中,可与相应抗原结合发挥多种免疫功能,由此在特异性体液免疫中发挥重要作用；而后者则做为B细胞抗原受体（BCR）存在与B细胞表面,在抗原识别、细胞活化、分化及程序性细胞死亡中起重要作用。Ig由两条重链和两条轻链构成,具典型折叠的结构域,每条肽链均包括可变区和恒定区,可变区可识别和结合抗原,恒定区和Ig的效应功能相关。Ig是最经典的免疫分子,其来源于B淋巴细胞及浆细胞,这一观点早已成为学术界的共识。然而,近年有关非B细胞可产生Ig分子的现象已逐渐被许多国内外学者所证实与接受。最先报道该现象的是北京大学邱晓彦教授,她在实践工作中发现,上皮来源肿瘤细胞及部分增生正常上皮细胞也可以产生Ig。邱晓彦教授课题组初步的功能研究发现该Ig可能具有生长因子样活性,进一步研究表明,癌细胞产生的Ig分子在结构及基因表达调控机制均异于B淋巴细胞的典型特征。上述发现发表于2003年的Cancer Research,并被评为2004年中国医药研究领域十大新闻之一。B细胞可产生大量的不同特异性的Ig来应对种类繁多的抗原。Ig以其可变区（V区）结合抗原,因此V区的多样性是能够保证产生应对、识别或结合理论上所有抗原的基础。Ig由胚系基因编码,这些基因片段通过基因重排才能成为功能性编码基因.Ig可变区的多样性源于其基因组在B淋巴细胞中发生的重排组合、连接过程以及B淋巴细胞经抗原刺激后诱发的高频突变。经典免疫学理论认为,Ig仅能在B淋巴细胞发育过程中进行选择性重排。而在其它体细胞中处于胚系状态或仅能发生不完全重排,因无功能性基因重排,故不会有Ig分子的产生。邱晓彦教授课题组通过激光显微切割（LCM）及RT-PCR技术,发现上皮来源肿瘤细胞,包括肺癌、乳腺癌、肠癌、胃癌、鼻咽癌、胰腺癌、卵巢癌等及部分正常上皮细胞内Ig同样存在功能性基因重排,重链VDJ片段的使用频率呈现明显的倾向性,不同病例、不同类型的肿瘤细胞可表达完全相同的可变区序列,同一个体、甚至不同个体肿瘤来源的Ig序列表达高度同源,这些序列在B细胞表达Ig数据库中均未发现,提示其确非B细胞产生,而是由肿瘤细胞产生。这种Ig基因转录本具有独特的基因结构,在不同组织类型的肿瘤细胞,特别是轻链在所有检测病例均表达同一结构的保守序列或极其相似的重排模式（个别碱基的替换）,即Vκ4-1-Jκ3型Ig转录本（专利申请号为200510107833.9）。鉴于Vκ4-1-Jκ3型Igs是从肿瘤中发现,因此其有可能成为肿瘤研究、诊断乃至治疗的靶点,而将这种可能付诸实践的关键之一是针对Vκ4-1-Jκ3结构特异性抗体的获得。作为与北京大学邱晓彦教授的合作课题,之前研究已利用生物信息学方法分析预测了V1κ4-1-JK3型Ig两个较为特异的B细胞识别表位,设计合成三个短肽,分别为AL13（序列ASINCKSSQRVSL）,QF20 （QAEDVAVYYC QQYYDTPVTF）, AL13B （TQSPDSLVVSLGERASINCKSSQRVSLG,即AL13的延长序列）,同时获得由邱晓彦教授课题组提供的原核表达Vκ4-1-Jκ3型Ig纯化融合蛋白（GST-Vκ4-1-Jκ3）。分别以合成肽AL13B-KLH、原核蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3免疫小鼠获得系列单克隆抗体。抗Vκ-1-Jκ3型Ig特异性表位抗体的获得,为研究非B细胞、血液及组织液中Vκ4-1-Jκ3型Ig表达提供有效工具。本研究的主要目的是抗Vκ4-1-Jκ3型Ig特异性表位单抗的鉴定与应用,具体包括双夹心ELISA检测体系的建立及Vκ4-1-Jκ3型Ig表达谱的筛查。我们用ELISA、Western Blot等鉴定抗体的特异性,这部分工作主要是前期抗VK4-1-JK3型Ig单抗制备工作的继续。在实验过程中,还发现Vκ4-1-Jκ3型Igκ可表达在一些正常组织及正常人血清中。因该Igκ的发现起源于上皮来源肿瘤细胞,拟建立双夹心ELISA检测体系,检测可溶性（分泌型）Vκ4-1-Jκ3型Igκ,并研究其存在及生物学意义。此外,利用胎儿组织芯片、部分肿瘤细胞系对Vκ4-1-Jκ3型Ig的表达、分布及定位做了初步的探索,可能为后续研究提供有价值的思路。第一章单抗用于鉴定正常人血清中的Vκ4-1-Jκ3分子虽然Vκ4-1-Jκ3型Ig的高使用频率是发现于上皮性肿瘤,但其基本结构与正常Ig相同,为此,我们对正常人血清中该分子的表达特性做了初步鉴定。主要研究抗Vκ4—1/Jκ3型Ig单抗特异性鉴定及正常人血清Vκ4-1-JK3型Ig特性鉴定。此前已用原核蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3免疫小鼠获得了单克隆抗体1A3与4E9；用合成肽AL13B-KLH免疫小鼠获得单克隆抗体6G5与3H9.2。通过SDS-PAGE、ELISA及Western Blot等鉴定抗体的特异性及纯度。结果显示经还原变性处理的4种单抗的重、轻链分子量符合理论值,杂带少,纯度高,提示可用于后续实验。抗Vκ4—1/Jκ3型Ig单抗能特异性地与原核重组蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3及含Vκ4-1-Jκ3序列的合成28肽结合,且与其他种属IgG无交叉反应。通过Western Blot发现正常人血清中亦存在Vκ4-1-Jκ3型Ig,并用3H9.2亲和层析柱从血清（血浆）中获得纯化的Vκ4-1-Jκ3型蛋白。经鉴定亲和层析纯化产物具有完整的Ig结构,且与四种抗Vκ4-1-Jκ3单抗均能特异性结合。此外,用Western Blot证明正常人血清Vκ4-1-Jκ3型Ig具有IgG、IgM、IgA三种存在形式。提示该单抗用于研究患者标本时需考虑这三种Ig同种型（isotype）的表达及其意义。第二章双夹心ELISA检测Vκ4-1-Jκ3型Ig体系的建立与应用本章工作的主要目的是建立双夹心ELISA检测体系,并以此检测正常人与肿瘤患者Vκ4-1-Jκ3型Ig水平及表达规律。我们用课题组自行研发的四种单抗排列组合确定捕获抗体与检测抗体,以此建立双抗夹心体系检测血清Vκ4-1-Jκ3型Ig,结果发现四种单抗相互组合的非特异性结合较高,于是改用四种特异性单抗分别与HRP-兔抗人IgG、HRP-羊抗人IgM、HRP-羊抗人IgA组成双抗夹心体系。这种组合方式恰恰让我们发现了血清中不同Ig类别的V1κ4-1-JK3型分子。在选择双抗体夹心ELISA检测体系时,也尝试过以鼠抗人IgG单抗、鼠抗人IgM单抗、鼠抗人Ig K链单抗及羊抗人IgG多抗、羊抗人IgM多抗、羊抗人IgA多抗作为捕获抗体,HRP-1A3、HRP-4E9、HRP-6G5、HRP-3H9.2为检测抗体,均配对失败。通过实验,筛选出以1A3作为捕获抗体,HRP-兔抗人IgG、HRP-羊抗人IgM、HRP-羊抗人IgA为检测抗体的双夹心ELISA检测体系灵敏度高,非特异反应低；以方阵滴定法确定最佳双夹心ELISA抗体工作浓度,初步建立双夹心ELISA检测体系标准曲线。因仅通过亲和层析法获得血清Vκ4-1-Jκ3型Ig量有限,且不如在血清中稳定,无法满足试验中作为标准品的需求,于是通过筛选鉴定确定了标准血清替代物。初步确定以检测血清中Vκ4-1-Jκ3型IgG/IgM/IgA滴度来定量。从海军医院及珠江医院检验科获取正常人血清200份、上皮性肿瘤患者血清155份,经双夹心ELISA检测,统计结果显示正常人与肿瘤患者血清Vκ4-1-Jκ3型Ig滴度存在明显差别,表现为：肿瘤患者血清的Vκ4-1-Jκ3型IgG与IgA含量明显高于正常人（P<0.01,P<0.001）；而Vκ4-1-Jκ3型IgM低于正常人（P<0.001）。第三章抗Vκ4-1-Jκ3单抗用于细胞学研究鉴于Vκ4-1-Jκ3选择性使用现象是发现于上皮样肿瘤细胞,而本工作也源于非B细胞来源Ig的探索,因而在获得了IgK的V区特异性抗体后,我们尝试去了解这种Vκ4-1-JK3型分子的表达,尤其是在非B淋巴细胞及其组织的表达,同时,也对抗体的功能做了初步的探索。因Ig表达或分泌于B细胞是经典的概念,我们暂称在非B细胞的表达为非经典的表达。Vκ4-1-Jκ3在上皮样肿瘤细胞的表达已由北京大学免疫系做了广泛而深入的研究,我们选择的是部分肿瘤细胞系、中性粒细胞及人胎儿组织。采用的方法是流式细胞术、激光共聚焦显微镜与免疫组化。结果显示：抗Vκ4-1-Jκ3单克隆抗体可结合人外周血粒细胞与中性粒细胞系HL-60细胞膜,并且可与商品化抗IgG及抗Igκ共定位,抗Vκ4-1-Jκ3单克隆抗体还可影响正常人中性粒细胞吞噬功能及抑制肿瘤细胞株HepG2、HL-60的增殖；甚至可与RAG2-小鼠（无T、B及NK细胞）的粒细胞结合。该现象未曾见任何报道,我们仍在继续研究其意义。第四章TLR-2激动剂对耐受型树突状细胞功能的逆转该部分工作系本人作为基本技术训练所承担的国家自然科学基金课题的部分内容,该工作建立了IL-10转染小鼠树突状细胞的工作平台,并证实了TLR2激动剂Pam3CK可有效逆转IL-10转染小鼠髓样树突状细胞免疫功能。近年来,更多的工作关注DC在免疫调节方面的作用,包括DC诱导及维持耐受的能力[24]。具有免疫调节性能的DC在静息状态对中枢及外周的自身抗原保持耐受,并能在体外诱导耐受以治疗移植排斥反应、自身免疫性疾病。在特定环境条件下,IL-10作用的DC能诱导抗原特异性的免疫耐受的形成,从而被称为耐受型树突状细胞。我们采用转染IL-10至小鼠髓样树突状细胞,结果显示流式检测CDllc阳性细胞90%以上,IL-10转染DC 48小时在106细胞上清中IL-10约为300pg/ml,提示成功地建立了可分泌IL-10的树突状细胞。用TLR2配体Pam3CK刺激48小时,利用流式细胞仪检测DC表面标志MHCⅡ、CD80、CD86及FasL; ELISA检测细胞产生IL-6,TNF-a。结果显示：IL-10抑制mDC表达CD80、CD86及MHCⅡ类分子,降低其分泌IL-6与TNF-a,促进其表达FasL。而TLR2激动剂刺激提高了IL-10转染DC表达MHCⅡ类分子及CD80,CD86,促进其产生IL-6及TNF-a,抑制了FasL表达。该结果证明TLR2激动剂可有效逆转IL-10诱发的DC免疫应答低下。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 单抗用于鉴定正常人血清VK4-1-JK3分子
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第二章 双夹心ELISA检测血清VK4-1-JK3型IG体系的建立与应用
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 抗VK4-1-JK3单抗用于细胞学研究
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 TLR-2激动剂对耐受型树突状细胞功能的逆转
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 攻读学位期间发表论文
• 致谢
• 统计学证明