肝癌肝移植预后相关的生物标志物筛选及血清诊断预测模型建立

论文摘要

原位肝移植是治疗肝细胞癌最有效的方法，因为肝移植除去了肝癌发生的根源，并且可以达到根治术的最大范围。由于早期肝癌肝移植缺少明确的手术适应症，患者生存率令人失望，近几年国内外多个中心提出了受体选择的标准，使肝癌肝移植术后生存率接近良性疾病，但现有标准多是基于影像学检查和病理形态学分级，不能完全反映肿瘤的生物学特性，对判断预后的灵敏度和特异性还有待提高。 新兴的蛋白组学，是对基因组所编码的所有蛋白质进行研究的学科。通过蛋白质组学使我们对肿瘤的发生、发展有了更详尽的理解，并能够通过发现特异的分子标志物来预测患者预后和治疗效果。 表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱技术（surface enhanced laser desorption／ionization，time of flight，mass spectroscopy SELDI-TOF-MS）是蛋白质组学新兴运用的技术，已有众多的研究组利用该技术在患者体液中发现了能够早期诊断肿瘤的标志物。本课题研究目的就是希望在肝移植患者的术前血清和肿瘤细胞中找到能够预示患者预后的分子标记物，并建立血清蛋白质组的诊断和预测模型。 第一部分 影响肝癌肝移植预后因素分析及复发的预防 本部分研究目的是分析影响肝癌肝移植预后的临床病理因素，总结预防复发的措施，为后续研究奠定基础。通过对254例肝癌肝移植患者临床病理特征进行生存率、无瘤生存率的比较（单因素分析），并使用Cox多因素分析得到有独立意义的预后指标。 结果： 1．254例肝癌肝移植患者0.5年、1年、2年生存率为89.3％、79.4％、66.7％，无瘤生存率为85.6％、76.4％、71.6％。 2．单因素分析提示肿瘤大小、肿瘤侵犯血管程度、组织Edmondson分级、TNM分期、术前甲胎蛋白（AFP）影响患者无瘤生存率，并且前四个因素与患者生存率相关。 3．Cox多因素分析示肿瘤侵犯血管是影响患者生存和肿瘤复发的独立因素。第二部分 蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术平台的建立 本部分研究目的是建立蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术平台，选择最优化的试验条件。选择肝癌肝移植患者术前血清和肿瘤细胞全蛋白裂解液各8例，采用弱阳离子交换芯片（WCX2或CM10）、强阴离子交换芯片（SAX2）、固定金属亲和表面芯片（IMAC3）、反相疏水芯片（H4）四种蛋白质芯片，经SELDI-TOF-MS测定蛋白质谱，筛选适合分析血清和组织细胞裂解液的最佳蛋白质芯片，摸索芯片技术参数，评估该技术的稳定性和可靠性。 结果： 1．血清和肿瘤细胞经四种芯片检测出蛋白质质荷比（M／Z）一般在2000～30000范围内。 2．血清和肿瘤细胞蛋白质图谱显示峰最多的都是WCX2芯片。 3．同一芯片内蛋白质峰强度的变异系数（CV）值为0.152，M／Z的CV值为0.0001。 4．不同芯片间蛋白质峰强度的CV值为0.157，M／Z的CV值为0.0004。 第三部分 与肝癌肝移植复发相关的肿瘤组织标记物筛选 本部分研究目的筛选肝肿瘤细胞中与肝移植术后复发转移相关的差异蛋白，为进一步寻找与预后相关的生物标记物提供研究基础，并作为第四部分血清蛋白研究的对照。通过选择肝癌肝移植术后复发患者组织标本20例，无瘤生存患者22例，组织中提取的肿瘤细胞经裂解后，利用WCX2蛋白质芯片，建立肿瘤细胞全蛋白质指纹图谱，参数设置如下：激光强度185，检测器灵敏度8，检测分子量范围集中在2000～30000Da，Biomarker Wizard软件比较两组肿瘤细胞之间蛋白质差异。 结果： 1．在M／Z 2000～30000范围内，共检测出101个蛋白峰，WCX2芯片建立的蛋白指纹图谱中，复发和无瘤生存组相比较有35个蛋白差异有统计学意义（P＜0.05）。 2．复发组中蛋白上调26个，M／Z为2308、2495、2990、5994、3246、4231、2762、3746、6791、2948、2972、3112、3277、4263、4131、1690、6747、4560、6721、1791、2401、2551、7097、1854、3172、4046。3．复发组中蛋白下调9个，M／Z为6171、1683、12323、7707、1994、5361、9621、10226、6332。 4．WCX2芯片筛选出的肿瘤细胞差异蛋白可能与肿瘤大小、肿瘤侵犯血管和移植前肝外微小转移灶相关。 第四部分 与肝癌肝移植复发相关的术前血清生物标记物筛选和诊断预测模型建立 本部分研究目的筛选与肝癌肝移植术后复发相关的血清生物标记物并建立诊断预测模型；同时结合第三部分试验，观察血清差异蛋白与肿瘤细胞差异蛋白有无联系。通过收集107例肝癌肝移植患者术前血清，采用WCX2芯片为检测介质，参数设置如下：激光强度185，检测器灵敏度8，检测分子量范围集中在2000～30000Da，经SELDI-TOF-MS测定得到蛋白质谱，通过Ciphergen ProteinChip Software标化，通过Biomarker Wizard软件比较复发组和无瘤生存组间血清蛋白质差异，利用Biomarker Patterns System软件建立与移植术后复发相关的诊断预测模型并进行盲法验证。 结果： 1．对可能影响血清蛋白质组变化的临床病理特征进行比较：两组患者年龄、性别、术前治疗、Child—Pugh分级、肾功能、肿瘤数目、组织学分化、包膜、AFP、术前肝炎状态无明显差异（P＞0.05），而肿瘤大小、血管侵犯程度在两组之间有明显差异。 2．在M／Z 2000～30000范围内，共检测出115个蛋白峰，比较复发组与无瘤生存组血清蛋白质图谱，19个蛋白峰有显著差异（P＜0.05），M／Z为4897、4659、2146、2780、6784、5758、5530、4878、2832、2938、5634、6443、3517、3574的蛋白峰在复发组中上调，而M／Z为28123、2197、2476、2293、2236的蛋白峰在复发组中下调，术前血清差异蛋白峰与肿瘤细胞的差异蛋白峰没有重复。 3．64例肝癌肝移植患者的血清蛋白谱建立的复发决策树判断模型，由M／Z为4897、4659、2146、2780的4个蛋白峰组成，其敏感性为93.33％（28／30），特异性为82.35％（28／34）。 4．对43例肝癌肝移植患者血清蛋白谱进行盲法验证，该模型盲法验证灵敏性89.47％（17／19），特异性83.33％（20／24）。结论 1．通过多因素分析，肿瘤侵犯血管是影响肝癌肝移植患者预后最重要的危险因素。临床工作中迫切需要更多敏感、特异的肿瘤标志物来提高肝癌肝移植术前诊断的准确性和了解患者的预后，如何在移植前发现肝外微小转移将是未来工作的重点。 2．SELDI蛋白芯片技术具有快速、操作简便、样品用量少和高通量等特点，其技术重复性和稳定性较好，是比较理想的蛋白质组学研究技术平台；WCX2芯片对肝癌肝移植患者血清蛋白质图谱和肿瘤细胞蛋白质图谱显示蛋白峰较多且质量较高，WCX2芯片可作为本研究的主要芯片。 3．由WCX2芯片筛选出的肿瘤细胞以及术前血清差异蛋白峰可能与肝癌肝移植术后复发有关；决策树模型对诊断移植前肝外微小转移和预测患者预后有重要的临床意义。 创新点： 1．建立了肝癌肝移植患者肿瘤细胞和术前血清蛋白质指纹图谱； 2．首次从血清学蛋白质组角度建立术前肝癌肝移植的诊断和预测模型； 3．实验筛选出的差异蛋白为选择受体、预测肝癌肝移植预后提供灵敏和特异的指标；在这些差异蛋白中可能会发现提示有肝外微小转移的分子标记物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 参考文献
• 第一部分 影响肝癌肝移植预后因素分析及复发的预防
• 摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术平台的建立
• 摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 与肝癌肝移植复发相关的肿瘤组织标记物筛选
• 摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 与肝癌肝移植复发相关的术前血清生物标记物筛选和诊断预测模型建立
• 摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 文献综述
• 附件
• 后记（致谢）