论文摘要
目的端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶的催化亚基,能够以端粒酶RNA为模板逆转录合成端粒DNA。它的表达与端粒酶活性呈正相关,限于生殖细胞、干细胞和90%以上的恶性肿瘤细胞,而在大多数正常人体细胞没有表达。由于hTERT与肿瘤的发生、发展关系密切,近年来成为研究的热点。随着研究的深入,发现hTERT的功能不仅仅是合成端粒,在抵抗细胞凋亡、促进细胞增殖等方面也发挥重要作用。为了进一步研究hTERT新的生物学功能,探讨其与肿瘤相关的作用机制,本文应用RNA干扰技术进行如下研究:第一部分,化学合成siRNA-hTERT,观察其在HeLa细胞中抑制hTERT的表达情况,筛选出有效的干扰序列;第二部分,检测hTERT基因沉默后HeLa细胞中癌症相关基因表达的变化;第三部分,研究hTERT基因沉默诱导HeLa细胞凋亡的途径。方法第一部分,实验分8组:A组为空白对照组,细胞不加处理因素;B组为转染试剂对照组,只加转染试剂;C组为阴性对照组,转染非特异siRNA;S1～5组为siRNA-hTERT组,转染特异siRNA。根据hTERT基因序列及其二级结构,依据Tuschl等siRNA设计原则,设计合成5条针对hTERT基因的siRNA;利用专用脂质体转染试剂RNAi-Mate将siRNA转染至HeLa细胞中,采用半定量RT-PCR法和Western blot筛选有效的干扰序列;MTT法检测siRNA对细胞生长增殖的抑制效应。第二部分,按Trizol法分别抽提S3组、S4组和空白组细胞总RNA,并进一步纯化总RNA,应用琼脂糖凝胶电泳判断评价总RNA的质量,分离mRNA;参照Schena等的方法逆转录cDNA探针并标记mRNA,分别用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP标记不同组的mRNA;将含混合探针的杂交液与芯片变性后,将杂交液滴于芯片点样区,用盖玻片覆盖,置于杂交盒中,杂交过夜;使用激光共聚焦荧光扫描仪扫描芯片,用ImaGene软件分析数据;采用Western blot法验证差异表达基因。第三部分,实验分5组:空白对照组,转染试剂对照组,非特异阴性对照组,S3、S4特异干扰组。转染后48小时,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;转染后48小时比色法测定各组Caspase-3和Caspase-8的活性;转染后48小时,提取各组细胞胞浆蛋白,Western blot法检测各组细胞胞浆Cyt c含量。结果第一部分,RNAi-Mate能有效的将siRNA转染至细胞内,各特异性siRNA转染组hTERT mRNA表达水平有不同程度的下降,以S3、S4转染组最为显著,而在各对照组内hTERT mRNA水平无明显变化;Western blot显示的蛋白表达变化与mRNA变化趋势相一致;MTT结果显示,转染24后,两个特异干扰组S3、S4与阴性对照组比较,细胞增殖抑制率均显著增高（P＜0.01）,两个特异干扰组之间比较无显著性差异（P＞0.05）。第二部分,芯片分析结果显示,在干扰组与对照组之间的差异表达基因中,EGFR、VEGF、bcl-2三个基因表达下调,TRAIL基因表达上调;Western blot结果显示,各基因的蛋白水平变化与芯片筛选结果一致。第三部分,运用流式细胞术进行细胞凋亡率分析显示,各对照组之间的细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）,而两个干扰组与对照组比较,凋亡率均显著增高（P＜0.01）,两个干扰组之间比较无显著性差异（P＞0.05）;转染后48小时,各组的caspase-8活性比无显著性差异（P＞0.05）,而两个干扰组的caspase-3活性比与对照组比较差异有显著性（P＜0.01）,均表现为活性比增高;Western blot结果显示,两个干扰组的胞浆Cyt c蛋白含量较对照组也有显著的增高。结论1、化学合成的靶向hTERT的siRNA能有效抑制HeLa细胞中hTERT的表达,并能抑制HeLa细胞增殖。2、靶向hTERT的siRNA能下调EGFR、VEGF、bcl-2基因的表达,上调TRAIL基因表达。3、靶向hTERT的siRNA通过激活线粒体途径诱导HeLa细胞凋亡。