Ad-HGF对大鼠肝纤维化的基因治疗

论文摘要

肝纤维化是各种致病因子持续作用于肝脏所导致各种慢性肝病的共同结果,是一种受损肝细胞的修复性反应。肝星状细胞的活化被公认为是各种慢性肝病最终向肝纤维化转变的必要条件。同时,许多细胞因子参与到肝纤维化的过程中,其中以转化生长因子β1（TGF-β1）最为关键。TGF-β1可以促进肝星状细胞的活化、细胞外基质的沉积并抑制胶原纤维的降解。肝细胞生长因子（HGF）是一种具有促肝细胞有丝分裂、抑制肝细胞凋亡、抑制肝细胞炎症等作用的多功能细胞因子。考虑到肝细胞生长因子的缺乏可能与慢性肝病的发生息息相关,而肝纤维化又是各种慢性肝病的共同结果,因此认为给予一定量的肝细胞生长因子可能是改善肝纤维化的一种崭新的治疗策略。目的观察不同时间点CCl4复合因素诱导的大鼠肝纤维化模型的变化,寻求最佳的给药时间点和实验结束的时间点。观察肝细胞生长因子（HGF）对CCl4复合因素诱导的肝纤维化大鼠基因治疗的效果,探讨Ad-HGF逆转肝纤维化的作用机制。方法1.观察CCl4复合因素诱导的肝纤维化大鼠的动态变化40只雄性Wistar大鼠,随机分为两个大组:模型组（25只）、正常对照组（15只）。模型组大鼠采用CCl4复合法（40%CCl4/橄榄油、高脂低蛋白饲料、5%乙醇）制备大鼠肝纤维化模型,正常对照组大鼠皮下注射等量的橄榄油。于造模的1周,4周,8周末,从模型组和正常对照组中分别随机各选取5只大鼠组成:1周模型组、1周正常组、4周模型组、4周正常组、8周模型组、8周正常组,并于这3个相应的时间点被分别处死。检测大鼠血清生化指标（GOT、GPT、TP、ALB、TBil ）、肝指数以及肝组织中羟脯氨酸含量的变化;通过HE染色观察肝脏组织病理学变化。确定最佳的给药时间点和实验结束的时间点。2.观察Ad-HGF对大鼠肝纤维化的治疗作用25只雄性Wistar大鼠随机平均分为5组:模型组,正常对照组,低（1×109 pfu）、中（2.5×109 pfu）、高（5×109 pfu）剂量治疗组。模型组和治疗组大鼠均采用CCl4复合法（40%CCl4/橄榄油、高脂低蛋白饲料、5%乙醇）制备大鼠肝纤维化模型,正常对照组大鼠皮下注射等量的橄榄油。从最佳的给药时间点开始,低、中、高剂量治疗组大鼠分别经尾静脉注射相应剂量Ad-HGF（3次/周,iv×2 wk）,模型组和正常组大鼠给予等体积生理盐水。在最佳的实验结束时间点,处死所有大鼠。检测血清生化指标（GOT、GPT、TP、ALB、TBil ）以及肝组织中Hpy的含量;通过HE染色观察肝脏组织病理学变化;通过天狼星染色观察肝脏组织中胶原的分布,并采用美国Image—Pro Plus专业图像分析软件对天狼星染色的切片胶原面积进行定量分析;运用免疫组化方法检测大鼠肝组织中HGF和TGF-β1的表达,其阳性区域采用美国Image—Pro Plus专业图像分析软件进行定量分析。结果1.模型大鼠肝纤维化的阶段性变化与1周正常组比较,1周模型组大鼠血清生化指标GOT、GPT、TBil（均P<0.01）和肝指数（P<0.05）显著地升高;与4周正常组比较,4周模型组大鼠血清中GOT、GPT、TBil,肝指数以及肝组织中Hyp含量均有显著（均P<0.01）的升高,TP, ALB有显著（均P<0.05）的下降。与8周正常组比较,8周模型大鼠血清中TP、ALB显著（均P<0.01）下降,GOT、GPT、TBil（均P<0.05）以及肝组织中Hyp含量（P<0.01）均显著增高。病理组织学检测结果表明:造模1周时,未见纤维组织形成;造模4周时,见大量纤维组织形成;造模8周时,见假小叶形成。确定最佳的给药时间点为造模4周末;最佳的实验终止的时间点为造模8周末。2.Ad-HGF基因治疗大鼠抗肝纤维化的作用与模型组比较,高剂量组大鼠血清中的GOT、GPT、TP、ALB、TBil都有明显的改善（P<0.05）,中剂量组和高剂量组肝组织中的胶原面积（P<0.05）、Hyp的含量（P<0.05）、肝细胞损伤程度和肝纤维化程度（P<0.01）都有显著的下降。免疫组织化学结果显示:与模型组比较,Ad-HGF在低、中、高剂量组均可以显著地提高肝组织中HGF蛋白的表达（P<0.05）,显著地降低肝组织中TGF-β1的表达（P<0.05）。结论1.CCl4复合因素诱导的模型大鼠出现阶段性肝纤维化改变。造模4周末是比较理想的给药时间点,造模8周末是比较理想的造模结束的时间点。2. Ad-HGF基因治疗对CCl4诱导的大鼠肝纤维化具有阻断作用;其作用机制:1)促进HGF基因在肝组织中的表达,从而发挥其促肝细胞再生、抑制肝细胞凋亡、减轻肝细胞损伤程度等作用; 2)抑制TGF-β1表达,促进胶原降解;抑制细胞外基质的沉积,最终阻断肝纤维化的进程。Ad-HGF是一种比较合理的肝纤维化基因治疗药物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 2 材料
• 2.1 受试品
• 2.2 实验动物
• 2.3 试剂
• 2.4 仪器
• 3 方法
• 3.1 大鼠肝纤维化模型的建立
• 3.2 Ad-HGF 基因治疗肝纤维化大鼠的研究
• 3.3 统计学处理
• 4 结果
• 4.1 模型大鼠肝纤维化程度的阶段性变化
• 4.2 Ad-HGF 基因治疗大鼠肝纤维化的作用
• 5 讨论
• 5.1 四氯化碳复合法制备大鼠肝纤维化模型
• 5.2 Ad-HGF 抗肝纤维化的基因治疗的效果
• 5.3 HGF 抗肝纤维化的机制
• 5.4 Ad-HGF 肝纤维化的基因治疗的前景
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述 （HGF 对肝纤维化治疗的研究）
• 参考文献