华癸中慢生根瘤菌7653R细胞分裂相关基因ftsZ1的缺失突变和共生表型研究

论文摘要

ftsZ基因是一个重要的细胞分裂相关基因,在真细菌中保守存在,在部分古菌和真核生物中也有发现。FtsZ蛋白在原核细胞及叶绿体、线粒体等质体分裂过程中发挥重要作用。当染色质复制并完成拟核分离,FtsZ即最早出现在分裂位点,直接参与并起始细胞分裂环的形成。大多数物种一般只含有一个ftsZ基因,有些物种基因组含有两个或更多的ftsZ基因。研究发现多种根瘤菌基因组中含有两个ftsZ基因：ftsZ1和ftsZ2。FtsZ1和FtsZ2虽具有一定的同源性但存在结构上的差异。华癸中慢生根瘤菌7653R与紫云英共生形成不定型根瘤,具有不定型根瘤类菌体的典型分化特征,且其基因组中含有两个细胞分裂相关基因ftsZ。本研究旨在探讨其细胞分裂相关基因ftsZ1在类菌体分化发育过程中的功能。首先通过构建同源重组置换载体,利用三亲本接合转移和选择培养基,筛选获得双交换的ftsZ1缺失突变株Z5-17。对突变株的培养特征和共生表型进行了进一步的检测分析等实验研究。结果表明：培养条件下的Z5-17形态、大小和生长速度与野生菌株7653R没有明显差异；在共生条件下,与突变株z5-17共生的宿主紫云英植株表现出明显的氮饥饿状态,形成白色小瘤,仅检测到极微弱的固氮酶活性,但结瘤数量明显增多。根瘤组织石蜡切片和电镜切片观察发现,突变株z5-17类菌体细胞分化异常,功能性共生体形成受阻,根瘤菌持续性侵染-结瘤固氮的过程中断,根瘤表现出明显的提前衰老特征。最后,采用荧光定量PCR检测了ftsZ1基因的表达水平和特性,发现其白生培养条件下的表达水平明显高于共生条件。综合以上结果,不难看出ftsZ1基因突变虽不影响华癸中慢生根瘤菌7653R培养条件下的生理特性,但显著影响了其与紫云英的共生固氮功能,ftsZ1的正常表达为类菌体分化、并形成功能性共生体所必需。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1. 前言
• 1.1. 生物固氮
• 1.2. 根瘤菌-豆科植物共生固氮体系
• 1.2.1. 根瘤菌
• 1.2.2. 根瘤形成及共生体发育
• 1.2.3. 宿主植物的防卫应答
• 1.2.4. 根瘤菌的持续侵染模式和突变共生表型
• 1.2.5. 共生双方调控共生体分化发育的研究进展
• 1.3. FtsZ蛋白
• 1.3.1. FtsZ蛋白的发现
• 1.3.2. 细胞分裂调控机制
• 1.3.3. ftsz的分子进化
• 1.3.4. ftsZ基因的染色体定位
• 1.4. 研究目的及意义
• 2. 材料和方法
• 2.1. 材料
• 2.1.1. 供试质粒和菌株
• 2.1.2. 培养基
• 2.1.3. 缓冲液与试剂
• 2.1.4. 抗生素
• 2.1.5. 主要仪器设备
• 2.2. 方法
• 2.2.1. 根瘤菌总DNA提取
• 2.2.2. 重叠延伸PCR
• 2.2.3. 三亲本接合转移
• 2.2.4. 植物盆栽实验
• 2.2.5. 根瘤石蜡切片制作
• 2.2.6. RNA抽提和质量控制、电泳检测
• 2.2.7. RT-PCR
• 2.2.8. 荧光定量PCR分析
• 2.2.9. 固氮酶活测定
• 2.2.10. DNA和蛋白质序列分析
• 3. 结果与分析
• 3.1. 华癸中慢生根瘤菌7653RftsZ1基因缺失突变
• 3.1.1. PCR扩增M huakuii 7653RftsZ1同源基因
• 3.1.2. SOE PCR扩增基因缺失置换片段
• 3.1.3. 构建基因置换载体
• 3.1.4. 筛选双交换突变菌株
• 3.2. 突变体互补菌株构建
• 3.3. 突变菌株的自生表型研究
• 3.4. 突变菌株的共生表型研究
• 3.4.1. 植物盆栽下的共生表型测定
• 3.4.2. 根瘤和类菌体发育的显微观察
• 3.5. 目标基因ftsZ1的表达特征
• 3.6. M.huakuii 7653R的ftsZs基因及FtsZs蛋白分析
• 4. 讨论
• 4.1. 关于ftsZ1基因的突变植株表型
• 4.2. 关于ftsZ1突变引起的共生表型原因分析:植物防御应答
• 4.3. 根瘤菌ftsZ基因的特征性表达及其在类菌体发育中的功能思考
• 4.4. 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录