几种动物Musclin基因的克隆与表达

论文摘要

为了研究Musclin在畜禽骨骼肌中的作用,本文以猪、鸡、牛、羊和兔为研究对象,依据报道的人、小鼠和大鼠Musclin基因序列对猪、牛、羊、兔和鸡的ESTs库和UniGene进行搜索,利用搜索的ESTs拼接序列设计引物进行RT-PCR,成功克隆了各种动物的Musclin基因。最后选择猪的Musclin基因进行原核表达、蛋白纯化和Western blotting鉴定。主要结果如下:羊Musclin基因的克隆与序列分析克隆的羊Musclin基因包含一个完整的开放阅读框架（open reading frame, ORF）,全长为413bp,编码由132个氨基酸残基组成的Musclin前蛋白,其中酸性氨基酸为19个,碱性氨基酸为24个,分子量为14.53 kDa,等电点为10.926。预测的信号肽区为27～28个氨基酸.成熟的Musclin由104～105个氨基酸组成。通过预测的氨基酸序列分析,在序列中含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域。兔Musclin基因的克隆与序列分析克隆的兔Musclin基因包含一个完整的开放阅读框架,其全长为409bp,编码有132个氨基酸。克隆的Musclin基因与小鼠、大鼠、人、猪和鸡的同源性分别为78.2%、79%、87.9%、98.2%和46.7%,推测的氨基酸序列同源性分别为73.1%、74.2%、87.9%、96.2%和56.8%,氨基酸序列含有“KKKR”结构和与小鼠ANP,BNP,CNP蛋白的同源性区域。鸡Musclin基因的克隆与序列分析克隆测序结果表明,克隆的鸡Musclin基因序列中包含了完整的ORF,其ORF长度与人基因一致（402bp）,基因序列与哺乳类人、大鼠、小鼠相比较,同源性分别为74%,73%,70%。鸡Musclin推测编码氨基酸序列长度为133aa,SignalP预测信号肽为N-端1～30aa,氨基酸序列中含有“KKKR”结构和与小鼠ANP,BNP,CNP蛋白的同源性区域说明鸡Musclin结构特征与人、大鼠和小鼠Musclin相一致。氨基酸序列与哺乳类人、大鼠、小鼠的基因相比较,同源性分别为58%,54%,50%。牛Musclin基因的克隆与序列分析克隆的牛Musclin基因包含一个完整的开放阅读框架（open reading frame, ORF）,全长为413bp,编码由132个氨基酸残基组成的Musclin前蛋白,其中酸性氨基酸为19个,碱性氨基酸为24个,分子量为14.53 kDa,等电点为10.926。预测的信号肽区为27～28个氨基酸.成熟的Musclin由104～105个氨基酸组成。通过预测的氨基酸序列分析,在序列中含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域的结构特征。牛Musclin基因预测的氨基酸序列与人、大鼠、小鼠、猪和鸡的同源性分别为93.2%、80.3%、78.5%、84.1%和60.6%。其中牛的信号肽与人、大鼠、小鼠、猪和鸡的同源性分别为89.3%、84.6%、80.8%、82.1%和35.7%。牛的成熟肽与人、大鼠、小鼠、猪和鸡的同源性分别为93.3%、78.8%、76%、84.6%和67.6%。猪Musclin基因的克隆与序列分析电子克隆后序列长度651bp。ORF开放阅读框分析表明,开放阅读框长399 bp（54-452 bp）编码132个氨基酸。与人、小鼠和大鼠的骨骼肌肌肉素基因cDNA编码区有较高同源性,同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。猪肌肉素推测编码氨基酸序列长度为132aa,SignalP预测信号肽为N-端1～27aa,氨基酸序列中含有“KKKR”结构和与小鼠ANP,BNP,CNP蛋白的同源性区域说明猪肌肉素结构特征与人、大鼠和小鼠肌肉素相一致。与人、小鼠和大鼠的骨骼肌肌肉素蛋白序列同源性分别为87.1%、72.3%和72.7%。在开放阅读框两端设计特异引物,以骨骼肌总mRNA为模板进行RT-PCR实验验证,结果与电子克隆结果完全一致。将构建好的原核表达载体转入BL21大肠杆菌中进行表达,表达的蛋白条带大约38.59 kDa,和预期融合蛋白GST-Musclin的分子量一致。通过Western blotting的鉴定,证明得到的蛋白的确是融合蛋白。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 骨骼肌分泌的活性物质
• 1.1.1 骨骼肌分泌的细胞因子
• 1.1.2 骨骼肌分泌的脂肪因子
• 1.1.3 骨骼肌分泌的肌肉因子
• 1.1.4 骨骼肌分泌的心血管活性物质
• 1.2 骨骼肌表达的活性物质的病理生理意义
• 1.2.1 对骨骼肌自身的作用
• 1.2.2 对其它器官组织功能的影响
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 羊Musclin 基因的克隆
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.1.1 仪器与试剂
• 3.1.1.2 Musclin 基因的克隆
• 3.2 兔Musclin 基因的克隆
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.1.1 仪器与试剂
• 3.2.1.2 Musclin 基因的克隆
• 3.3 鸡Musclin 基因的克隆
• 3.3.1 材料和方法
• 3.3.1.1 仪器与试剂
• 3.3.1.2 Musclin 基因克隆
• 3.4 牛Musclin 基因的克隆
• 3.4.1 材料与方法
• 3.4.1.1 仪器与试剂
• 3.4.1.2 Musclin 基因克隆
• 3.5 猪Musclin基因的克隆
• 3.5.1 材料和方法
• 3.5.1.1 仪器与试剂
• 3.5.1.2 EST 电子克隆和分析
• 3.5.1.3 猪Musclin 原核表达纯化和鉴定
• 4 结果与分析
• 4.1 羊Musclin 基因的序列分析
• 4.1.1 羊Musclin 的RT-PCR 扩增及克隆
• 4.1.2 羊Musclin 的cDNA 序列
• 4.1.3 羊Musclin 基因cDNA 序列的种属差异
• 4.1.4 羊Musclin 基因氨基酸序列的种属差异
• 4.2 兔Musclin 基因的序列分析
• 4.2.1 兔Musclin 的RT-PCR 扩增及克隆
• 4.2.2 兔Musclin 的cDNA 序列
• 4.2.3 兔Musclin 基因cDNA 序列的种属差异
• 4.2.4 兔Musclin 基因氨基酸序列的种属差异
• 4.3 鸡Musclin 基因的序列分析
• 4.3.1 鸡Musclin 的RT-PCR 扩增及克隆
• 4.3.2 鸡Musclin 的cDNA 序列
• 4.3.3 鸡Musclin 基因cDNA 序列的种属差异
• 4.3.4 鸡Musclin 基因氨基酸序列的种属差异
• 4.4 牛Musclin 基因的序列分析
• 4.4.1 牛Musclin 的RT-PCR 扩增及克隆
• 4.4.2 牛Musclin 的cDNA 序列
• 4.4.3 牛Musclin 基因cDNA 序列的种属差异
• 4.4.4 牛Musclin 基因氨基酸序列的种属差
• 4.5 猪Musclin 基因的序列与表达分析
• 4.5.1 EST的电子克隆和开放阅读框RT-PCR验证
• 4.5.2 pGEX-4T-1-musclin在原核细胞中的表达结果
• 4.5.3 GST-Musclin融合蛋白纯化结果
• 4.5.4 Western blotting 检测结果
• 5 结论与讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录