冰岛硫化叶菌xpb基因的遗传学分析

论文摘要

核苷酸切除修复（NER）机制是细胞修复DNA损伤的重要途径之一。比较基因组学分析发现,绝大多数古菌拥有在真核生物NER途径中发挥作用的蛋白XPB、XPD、XPF和XPG的同源蛋白,但是它们缺乏大量能够在NER途径的调控回路中发挥作用的蛋白。因此,古菌的NER途径被认为是由真核系统中不可或缺的关键组分组成,它是研究复杂的真核NER机制的简易模型。超嗜热泉古菌冰岛硫化叶菌野生型菌株REY15A的基因组测序工作已经完成,并且在该菌中已建立了稳定的遗传操作工具和成熟的基因敲除方法。为了在体内研究古菌NER机制,利用“选择标记插入/无选择标记的基因缺失法”在超嗜热泉古菌冰岛硫化叶菌基因组中分别成功地缺失了编码真核生物NER解旋酶XPB同源蛋白的基因xpb1和xpb2,表明基因xpb1或xpb2不是冰岛硫化叶菌存活的必需基因。流式细胞分析显示,xpb2基因单缺失突变体相较出发菌株E233S（ΔpyrEFΔlacS）在细胞周期上并没有明显差异,但xpb1基因单缺失突变体的细胞群体中包含一部分细胞,它们体内含有多于2倍的DNA含量,暗示XPB1蛋白的功能不仅限于DNA修复,可能还涉及DNA复制等方面；表型分析发现,xpb1和xpb2基因单缺失突变体相较野生型菌株REY15A,对DNA损伤试剂4-NQO分别表现出轻微敏感性和不敏感性,表明NER解旋酶功能在冰岛硫化叶菌体内存在多重冗余。该研究是对泉古菌核苷酸切除修复机制的首次遗传学分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 古菌概述
• 1.2 模式生物冰岛硫化叶菌
• 1.3 冰岛硫化叶菌的遗传敲除体系
• 1.3.1 宿主菌株
• 1.3.2 选择标记
• 1.3.3 转化方法
• 1.3.4 基因敲除策略
• 1.4 古菌的核苷酸切除修复
• 1.4.1 古菌中细菌型NER途径研究进展
• 1.4.2 古菌中真核生物型NER途径研究进展
• 1.5 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要药品和试剂
• 2.1.3 培养基及试剂配方
• 2.1.4 分子操作类试剂盒
• 2.1.5 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因敲除原理
• 2.2.2 基因敲除载体构建过程
• 2.2.3 基因敲除载体的电转化
• 2.2.4 双交换转化子的筛选和验证
• 2.2.5 目的基因缺失突变体的筛选和验证
• 2.2.6 突变体的流式细胞分析
• 2.2.7 突变体的4-NQO处理
• 3 结果与分析
• 3.1 敲除载体构建片段的电泳检测
• 3.2 敲除载体的酶切验证和测序分析
• 3.3 双交换转化子的PCR验证
• 3.4 目的基因缺失突变体的PCR验证
• 3.5 突变体的流式细胞分析结果
• 3.6 突变体的4-NQO处理结果
• 4 讨论
• 4.1 MID基因敲除策略解析
• 4.2 突变体Mb1（Δxpbl）流式细胞分析
• 4.3 突变体4-NQO敏感性分析
• 参考文献
• 附录
• 致谢