论文摘要
缺乏肿瘤特异性是现今许多肿瘤治疗方案所共同面临的一个主要问题,因此研发出新的肿瘤靶向机制的治疗方法显得非常必要。肿瘤细胞特异性增殖病毒,又称溶瘤病毒,在肿瘤治疗中极具前景,它具有选择性地在肿瘤细胞中增殖、在肿瘤间自行扩散的优点,且同现有的治疗手段无交叉耐药作用。白细胞介素-18（IL-18）是最新发现的IL-18是一种重要的免疫调节因子,对多种肿瘤有明显的治疗作用。但是有关利用增殖腺病毒携带IL-18治疗肝癌的研究未见报道。为了实现治疗肝癌的目的,我们将IL18基因插入双调控增殖型腺病毒pSG600,构建携带IL18基因的增殖性腺病毒CNHK600-IL18。通过体外实验对CNHK600-IL18选择性杀伤肝癌细胞的能力进行评估,对其抗肿瘤机制进行初步探讨,取得了以下主要结果:1、携带IL-18基因的增殖腺病毒CNHK600-IL18的构建和制备。（1）SalⅠ和BamHⅠ双酶切T-IL18,回收623bp大小的DNA片段,与SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的pClon25连接,得到pClon25-IL18。将pClon25-IL18用AgeⅠ+NotⅠ+ EcoO109I三酶切,装入用AgeⅠ+NotⅠ双酶切的SG502-△CR2载体中,得到SG502-△CR2-IL18载体。（2）利用Lipofectamine2000试剂盒,将质粒SG502-△CR2-IL18与5型腺病毒骨架载体ppE3共转染293细胞。转染后9-14天出现病毒空斑,经过3次病毒空斑纯化,提取病毒DNA进行PCR鉴定,正确重组病毒命名为CNHK600-IL18。将病毒在293细胞中扩增,通过氯化铯梯度离心法纯化病毒,TCID50法测得重组腺病毒滴度达到6.9×109 pfu/ml。2、携带IL-18基因的增殖腺病毒CNHK600-IL18体外抗肿瘤疗效观察（。1）通过ELISA检测腺病毒CNHK600-IL18感染BJ后上清夜诱导活化的T细胞产生INF-γ的能力,实验结果表明,其能显著诱导T细胞产生INF-γ。（2）用重组腺病毒CNHK600-IL18感染不同来源的肝癌细胞株,观察不同时相（0h、48h和96h）的病毒增殖情况,实验表明SG600-IL18在多种实体瘤细胞中均显示出良好的增殖力。CNHK600-IL-18在BEL-7404和SMMC-7721中的96h增殖倍数分别是31 658和125 396,分别是在BJ增殖的400倍和1587倍,证明该病毒具有良好的肿瘤靶向性及安全性。与ONYX015相比,CNHK600-IL18能在很低浓度将肿瘤杀死。（3）MTT实验表明杀死50%的BEL-7404和SMMC-7721两种细胞所需CNHK600-IL-18的MOI值分别为10,正常BJ细胞为100。本文成功构建了携带IL18基因的增殖型腺病毒CNHK600-IL18,体外实验表明重组病毒CNHK600-IL18可以选择性地在肿瘤细胞中增殖、杀伤,而在正常细胞中增殖较少。其杀伤力要好于ONYX015。以上实验结果表明CNHK600-IL18结合了病毒治疗与基因治疗的优势,是一种特异、安全、高效的溶瘤病毒,为肝癌等实体瘤的生物治疗提供了一种新的工具。