论文摘要
目的:1.首次应用国内最先进的基因测序技术为基础,研究冠心病（CHD）的载脂蛋白E（ApoE）基因多态性分布,探究CHD发病遗传易感性的关系,为CHD临床及流行病学研究打下基础。2.探究ApoE基因多态性与CHD中医证型的相关性,为CHD临床辨证施治提供分子生物学依据。3.观察ApoE基因多态性对通心络胶囊干预CHD中医证型和血脂治疗效应的影响,阐述通心络胶囊治疗CHD的作用机制。4.通过通心络胶囊对载脂蛋白E基因敲除[ApoE（-/-）]模型组小鼠血脂、心肌、冠状动脉斑块、主动脉斑块病理组织学变化及血清血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）、内皮素（ET）、循环内皮细胞（CEC）、组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）、基质金属蛋白酶1（MMP1）和基质金属蛋白酶9（MMP9）水平等指标的干预变化,探究其与CHD ApoE基因多态性的相关度并试析其机理。方法:1.将2006年3月至2007年12月收集的118例符合纳入标准的不同证型CHD患者（全部来源于江苏省中医院心内科、老年科门诊及住院患者）设立为试验组,另设立123例健康人群为对照组（均来自江苏省中医院体检中心）。通过采集血标本,Promega公司血液基因组DNA提取试剂盒进行模板DNA的提取,PCR扩增后进行基因测序。将测序结果用DNA sequencing analysis 5.1自动分析原始测序数据,获得测序电泳图和序列。将样品序列用DNA star seqman与标准序列进行比对,观察样本基因序列的多态性改变,将正常对照组ApoE基因表型分布和等位基因频率比较;同时将CHD组患者的中医证型及其ApoE基因表型分布和等位基因频率相联系,并进行组间和组内比较分析。2.将临床收集的118例CHD患者随机设立为通心络胶囊治疗组和常规治疗对照组,通过采集血标本,以全自动生化分析仪检测血总胆固醇（TC）、三酸甘油酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等指标,同时记录并分析比较ApoE基因多态性和CHD的不同中医证型对中药通心络干预反应的差异及疗效。3.将40只ApoE（-/-）小鼠作为实验组,建立高脂血症和冠状动脉粥样硬化模型,随机分为模型组、辛伐他汀组、通心络胶囊高、中、低剂量组5组,分别给予辛伐他汀及不同剂量的通心络胶囊进行干预,另选8只同系的小鼠作为正常对照组。通过对TC、TG、HDL-C、LDL-C等指标变化,模型组小鼠心肌、冠状动脉斑块、主动脉斑块病理组织学变化及血清TXB2、6-Keto-PGF1α、ET、CEC、MMP1、MMP9和TIMP-1水平的观察、比较,分析通心络胶囊对ApoE（-/-）小鼠血脂的调节作用和对动脉粥样硬化的影响作用及机理。4.描述性统计分析,定性指标以频数表,百分率或构成比描述;定量指标以均数,标准差描述。两组对比分析,定性资料采用卡方检验,Fisher精确概率法,Wilcoxon秩和检验,CMHx2检验;定量资料符合正态分布用t检验（组间进行方差齐性检验,以0.05作为检验水准,方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验）,不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验,Wilcoxon符号秩和检验。假设检验统一使用双侧检验,给出检验统计量及其对应的P值。以P≤0.05作为有统计学意义,以P≤0.01作为有高度统计学意义。以上统计分析均用SAS统计软件进行处理。结果:1.118例CHD患者共检出E2/2、E3/3、E4/4三种纯合子和E2/3、E2/4、E3/4三种杂合子,且ApoE基因表型以E3/3纯合子占大多数,E2/2纯合子最低;CHD组携带的E2/4、E3/4、E4/4三种基因型频率较对照组有增加的趋势,差异有统计学意义（X2=5.004,P＜0.05）;而E3/3基因型其频率较对照组则有减少的趋势,差异有高度统计学意义（X2=6.8743,P＜0.01）。123例对照组中,等位基因分布频率则以ε3最高,占到74.39%。通过比较,CHD组ε3等位基因分布频率明显低于对照组（X2=9.2898,P＜0.05）,而ε4等位基因分布频率则明显高于对照组（X2=13.927,P＜0.01）,差异有高度统计学意义。2.118例入选的CHD患者,根据辨证分型标准,共分为以下6型:寒凝心脉证13例（占总例数的11.02%,以下同）,痰浊闭阻证29例（24.58%）,心血瘀阻证33例（27.96%）,心肾阴虚证11例（9.32%）,气阴两虚证27例（22.88%）,阳气虚衰证5例（4.24%）。3.118例入选的CHD患者不同中医证型检出的基因表型比例不一,经统计学分析可以看出:5例E2/2基因表型中仅见2例寒凝心脉证,痰浊闭阻证、心肾阴虚证、阳气虚衰证各1例;16例E2/3基因表型中以心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证为主,占该基因表型的75.0%;56例E3/3基因表型中心肾阴虚证、阳气虚衰证最少,仅占该基因表型的14.28%,而心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证最多,占75.00%;E3/4基因表型中心血瘀阻证、气阴两虚证比例相对较高,占该基因表型的52.94%;E4/4基因表型中也以心血瘀阻证和气阴两虚证为多,分别占该基因型的50.00%和43.75%。参照国内外丈献常将意义相近的基因表型合并分析的情况,我们也将E2/2基因表型和E2/3基因表型合并,E2/4、E3/4基因表型和E4/4基因表型合并,再与E3/3基因表型一起进行分析,结果表明:E2/4+E3/4+E4/4型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例最高,为82.93%;其次是E3/3型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例为75.00%;最低是E2/2+E2/3型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例为61.90%。经统计学分析可以看出,E2/4+E3/4+E4/4型中:痰浊闭阻证、心血瘀阻证、气阴两虚证相互比较P＞0.05,痰浊闭阻证、心血瘀阻证、气阴两虚证三种证型与寒凝心脉证、心肾阴虚组证、阳气虚衰证三种证型比较P＜0.05,说明CHD的主要证型为心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证。通过对CHD组不同中医证型ApoE等位基因频率比较,则发现:心血瘀阻证、气阴两虚证二种证型ε4等位基因频率明显高于寒凝心脉证、痰浊闭阻证、心肾阴虚证、阳气虚衰证四种证型（p＜0.05）;ε3等位基因频率不同中医证型间则大致相等;ε2等位基因频率不同中医证型间心血瘀阻证较低,而寒凝心脉证、心肾阴虚证、阳气虚衰证较高。4.ApoE多态性对通心络胶囊干预CHD疗效的影响方面:治疗组改善中医证型疗效优于对照组,p＜0.05。ε2、ε3、ε4各等位基因疗后气阴两虚证、痰浊闭阻证、心血瘀阻证均有明显改善（p＜0.05）,痰浊闭阻证的症状积分降低改善率最高,有统计学意义（p＜0.05）,其它各基因型间的气阴两虚证及心血瘀阻证改善率差异均无统计学意义（p＞0.05）。治疗组ε4型对于中药治疗改善痰浊闭阻证疗效最好,优于ε2、ε3型;对照组,各等位基因对于气阴两虚证、痰浊闭阻证、心血瘀阻证的症状积分改善率,差异无统计学意义,P＞0.05;两组组内同基因型疗前后自身比较,有统计学意义,P＜0.05。治疗组与对照组组内各不同基因型比较,TC、LDL-C降低和HDL-C升高的改善率,有统计学意义,P＜0.05;TG降低的改善率,差异无统计学意义,P＞0.05,提示两组各基因型对于TC、LDL-C降低和HDL-C升高均有疗效,而对TG的疗效影响无差异。治疗组与对照组组间各相同基因型间疗前后改善率比较,差异无统计学意义,P＞0.05,说明两组各相同基因型对于药物调脂反应相同。5.动物实验,首先造模成功,然后从以下三方面进行了研究:①通心络胶囊对ApoE（-/-）小鼠血脂的影响:模型组血清TC、TG和LDL-C均明显增高,HDL-C水平下降,与正常组相比均有统计学意义（p＜0.05）。通心络胶囊中、高剂量组小鼠的血清TC,TG和LDL-C均明显低于模型组,与模型组相比具有统计学意义（p＜0.05或P＜0.01）。通心络胶囊中、高剂量组小鼠的血清HDL-C水平高于模型组,与模型组相比具有统计学意义。低剂量组小鼠的血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平与模型组相比,差异无统计学意义（p＞0.05）。②通心络胶囊对ApoE（-/-）小鼠小鼠AS的影响:实验显示通心络胶囊对冠状动脉粥样硬化的形成有一定的抑制作用,其中以高剂量组效果最好,其作用强于中剂量组、低剂量组。模型组所有小鼠冠状动脉病变主要位于心肌内的小分支,动脉主干及大分支未见明显病变,CHD评分4.0±1.76;辛伐他汀组冠状血管及肝脏病变较模型组减轻,CHD评分为2.3±1.16;通心络低剂量组CHD评分为3.8±2.35,中剂量组CHD评分为3.0±1.25,高剂量组评分为1.7±2.06。不同组AS比较可见,通心络低剂量组与模型组间在AS心肌细胞变性坏死,心肌间质炎症、水肿,冠状动脉心内分支管壁脂质变性程度及管周脂质沉积等方面比较,差异无统计学意义（p＞0.05）,而辛伐他汀组和通心络中剂量组在这些方面与模型组却有统计学意义（P＜0.05）,通心络高剂量组则有高度统计学意义（P＜0.01）。实验显示:通心络胶囊对冠状动脉粥样硬化的形成有一定的抑制作用,其中以高剂量组效果最好,其作用强于中剂量组、低剂量组。通心络胶囊防治小鼠主动脉粥样硬化有一定的减轻作用,但各剂量组间无统计学意义。③通心络胶囊干预ApoE（-/-）小鼠冠状动脉粥样硬化形成机理的研究:通心络胶囊干预ApoE（-/-）小鼠后,通心络高、中、低剂量组和辛伐他汀组与模型组相比,血清TXB2、6-Keto-PGF1α含量差异均无统计学意义（P＞0.05）;但是,模型组ApoE（-/-）小鼠血清TXB2、6-Keto-PGF1α含量高于正常组,与正常组相比,有统计学意义（P＜0.05）。模型组小鼠血清ET含量高于正常组,与正常组相比,有统计学意义;通心络胶囊三个剂量组小鼠血清ET含量均低于模型组,与之相比,有高度统计学意义。通心络高剂量组在造模后第4、8、12周血中CEC均低于模型组,与模型组相比,有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）,而通心络中剂量组在造模后第4周和12周时血中CEC与模型组相比,有统计学意义（P＜0.05）,表明通心络胶囊可干预高血脂对血管内皮细胞的损伤作用。通心络高剂量组小鼠血清MMP1和MMP9水平均低于模型组,而TIMF-1水平高于模型组,与模型组相比,均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。通心络中、低剂量组小鼠血清MMP9水平低于模型组,与模型组相比有统计学意义（P＜0.05）。表明通心络胶囊有抑制实验性脂质紊乱及动脉硬化小鼠血清MMP1和MMP9活性作用。结论:1.CHD的主要证型为心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证。2.ε4基因是CHD的易感等位基因,是CHD发生的重要遗传易患因素,并可能与CHD患者心脏事件的的发生、发展和预后密切相关;密切关注ε4等位基因携带者的血脂水平,进行积极针对性地干预,将有利于防止或延缓冠心病的发生和发展。3.ε3等位基因可视为CHD发生的保护基因。4.CHD的主要基本证型心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证与ApoE E3/4、E4/4基因表型及ε4等位基因密切相关。ApoE基因多态性、血脂水平与CHD之间存在因果关系,ApoE不同基因型可通过血脂代谢作用而影响CHD的发病。5.通心络胶囊干预CHD总疗效显著;ApoE多态性对通心络胶囊干预CHD不同中医证型的疗效均具有影响,但对气阴两虚证、痰浊闭阻证、心血瘀阻证具有明显疗效,尤以ε4等位基因的痰浊闭阻证疗效最为显著;对于TC、LDL-C降低和HDL-C升高均有显著疗效。6.通心络胶囊可干预ApoE（-/-）小鼠血脂水平,并对血管内皮细胞的损伤、内皮功能和炎症因子的抑制有调节作用,从而有利于调节血脂、减轻冠状AS。7.在人群中进行ApoE基因多态性检测,对CHD的早期预防、监测和积极地针对性治疗均有较为重要的意义。8.临床上中医药辨证论治可以有效改善CHD患者症状,提高临床疗效。
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