论文摘要
目的：（1）构建大鼠创伤性深静脉血栓模型,筛选血栓形成前、血栓形成高峰期、血栓不形成相应状态下大鼠股静脉血管组织差异表达的基因和蛋白。（2）制定临床患者统一的诊断、纳入和排除标准,采集深静脉血栓形成不同时相点临床患者血液,筛选血栓形成组、血栓不形成组人静脉血液中差异表达的蛋白。（3）将大鼠股静脉壁组织中筛选出的差异蛋白、基因,与临床患者血液中筛选出的差异蛋白进行比对,筛选出与静脉血管内皮细胞和血液高度相关的差异蛋白（IL-1β、IL-6、A2M、Cathepsin D、Cathepsin G）。（4）进一步采用ELISA验证这些重要蛋白在人血中的表达变化,探讨这些蛋白可能参与内皮细胞损伤、血小板活化、炎性因子激活及相互作用的调控机制,促进血栓形成的作用。方法：分为四个部分：第一部分：150只SD大鼠采用股静脉钳夹联合下肢石膏制动构建大鼠TDVT模型,随机分为A组（对照组）10只、B组（创伤即刻组,0.5h）10只、C组（血栓形成前组,创伤后2.5小时）10只、D组（血栓形成组高峰组,创伤后24小时）10只、E组（血栓消退组,72h）10只、F组（血栓不消退组,72h）10只、G组（血栓不形成组,168h）10只、H组（血栓不形成组,创伤后24小时）10只。解剖大鼠股静脉,观测血栓的发生率及严重程度。获取股静脉血管壁组织,先采用Genechip Rat Genome 2302.0基因芯片检测血栓形成前、血栓形成高峰期、血栓不形成差异表达的基因。第二部分：再次构建大鼠TDVT模型,将100只SD大鼠,随机分为A组（对照组）10只、B组（血栓形成前组,创伤后2.5小时）20只、C组（血栓形成组,创伤后24小时）20只、D组（血栓不形成组,创伤后24小时）20只。解剖大鼠股静脉,观测血栓的发生率及严重程度。获取股静脉血管壁组织,采用双向凝胶电泳技术筛选血栓形成前、血栓形成高峰期差异表达的蛋白。第三部分：制定临床患者统一观察、诊断及纳入和排除标准,收集资料。分为正常对照组（A组,n=10）、血栓形成组（B组,n=10）,血栓不形成组（C组,n=10）。采集血样本,先采用双向凝胶电泳技术筛选血栓形成组及血栓不形成组差异表达的蛋白,并进一步与大鼠血管组织中差异表达的基因、蛋白进行对比分析,查阅文献,筛选出与静脉血管内皮细胞和血液高度相关的差异蛋白（IL-1β、IL-6、A2M、CathepsinD、CathepsinG）。第四部分：采用ELISA检测IL-1β、Cathepsin D、A2M蛋白在人血液中的表达变化。结果：（1）大鼠股静脉壁组织基因芯片检测结果：共有15864个基因,差异表达基因2458个,其中IL-1β等1146基因上调,占差异表达基因总数46.6%；下调1312个,占差异表达基因总数的53.4%。（2）大鼠股静脉壁组织双向凝胶电泳技术检测结果：选出21个差异蛋白质点,通过质谱分析鉴定出A2M等16种差异表达蛋白。（3）人血双向凝胶电泳技术检测结果：选出25个差异蛋白质点,通过质谱分析鉴定出Cathepsin D等20种差异表达蛋白。（4）分析、对比大鼠血管组织与人血液中差异表达的基因、蛋白,发现：IL-1β、IL-6、A2M、Cathepsin D、Cathepsin G基因及相应蛋白上调,促进血栓形成。（5）人血液中ELISA检测结果：在血栓形成即刻IL-1β、A2M、Cathepsin D开始呈轻度高表达,在血栓形成高峰期（B组）呈显著高表达,而在血栓不形成组（C组）呈轻度高表达,B组与C组和A组统计学比较有显著性差异。结论：（1）采用直接钳夹股静脉联合双后肢人字石膏固定的方法可以成功建立TDVT动物模型。该模型造模方法简便、血栓发生率高。（2）大鼠股静脉血管壁组织和人血液中,IL-1β、IL-6、Cathepsin D、Cathepsin G、A2M表达上调与DVT形成高度相关。（3）IL-1β、L-6、Cathepsin D、Cathepsin G、A2M可能在DVT形成过程中发挥重要作用,也许可以作为DVT预测诊断蛋白标记物之一。
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