阿魏酸通过调节钠离子通道（ENaC）介导骨形成的研究

论文摘要

目的:观察当归的水溶性单体成分阿魏酸（FA）对体外培养的成骨细胞（Ob）成骨功能的影响,并探讨其作用机制,为活血化瘀中药用于骨质疏松的防治提供理论依据。方法:以新生SD乳鼠头盖骨原代培养的Ob为研究对象,取第三代细胞进行药物实验,96孔板每孔加细胞100μl,细胞密度为1×104/mL,条件培养基中先加入不同浓度(0.001 - 1000 mg.L-1)的FA进行药物有效浓度筛选,然后选择FA的终浓度分别为7.8、31.2、125、500 mg.L-1进行实验,各浓度组设三复孔,应用CCK-8法、碱性磷酸酶（ALP）法、茜素红染色方法观察FA对体外培养的Ob的增殖、分化及矿化的影响,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化;Elisa检测FA作用后Ob内cGMP的表达, siRNA PKGⅡ沉默技术的应用,RT-PCR检测PKGⅠα、PKGⅠβ、PKGⅡ、ENaCα、ENaCγ等基因的表达,并检测FA对成骨相关指标Collagen-Ⅰ、ALP、Osteopontin等的表达。结果:（1）药效评价:FA在0.01 - 100 mg.L-1范围内可以促进Ob的增值（P<0.05）,至1000 mg.L-1时,其抑制Ob的增值（P<0.05）,在1 - 1000 mg.L-1范围内可以促进Ob的分化（P<0.05）,故选择FA 7.8 - 500 mg.L-1四个浓度组进行实验;与对照组比较,四个浓度组均具有刺激Ob增殖的作用（P<0.05）,组间比较,只有500 mg.L-1浓度组与其他组比较存在显著性增加（P<0.01）,流式细胞术检测细胞周期表明其可以增加G2/M期细胞含量;同时在7.8 - 500 mg.L-1浓度内,FA可以提高ALP活性（P<0.05）,四个浓度组中,除了31.2与125 mg.L-1浓度之间没有差异外,其他各组间都存在显著性差异（P<0.01）,随着浓度的增加,ALP增加;茜素红染色显示,7.8 - 250 mg.L-1的FA可以增加钙化结节的数量,其中7.8 mg.L-1浓度组的数量最多,而到500 mg.L-1浓度时,FA则不促进钙化结节的形成。RT-PCR的结果表明,FA在7.8 - 500 mg.L-1内促进成骨相关基因Collagen-Ⅰ、AKP、Osteopotin等的表达（P<0.05）,但未见剂量依赖关系。（2）作用机制研究:FA在7.8 - 500 mg.L-1浓度范围内可以促进Ob内cGMP的的分泌（P<0.01）,除了125与500 mg.L-1浓度之间没有差异外,7.8、31.2、125mg.L-1浓度间呈剂量依赖性增加（P<0.01,P<0.05）; RT-PCR的结果表明,FA在7.8 - 500 mg.L-1浓度范围内均可以促进cGMP信号通路的下游分子PKGⅡ基因的表达（P<0.05）,然而对PKGⅠα、PKGⅠβ等基因的表达无明显作用。同时ENaCα、ENaCγ基因的表达增加（P<0.05）;基因沉默实验结果表明,与空白对照组比较,转染siRNA PKGⅡ的Ob,ENaCαmRNA表达明显下调（P<0.05）,而FA加上转染siRNA PKGⅡ组的Ob的ENaCα的表达也上调（P<0.05）,其表达水平高于只转染siRNA PKGⅡ组（P<0.01）但低于FA单独作用于Ob组（P<0.05）。结论:FA具有刺激体外培养的Ob增殖、分化和矿化的功能,促进成骨相关基因的表达,其作用机制可能部分与cGMP-PKGⅡ-ENaC信号通路有关,也可能是并存FA或cGMP直接作用于ENaC的结果。此结果提示了当归等活血化瘀药在骨质疏松的防治中的作用和新的机制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 研究背景
• 1.1 概述
• 1.2 cGMP－PKGⅡ－ENaC 信号通路与骨形成的调节
• 2 研究目的
• 3 研究内容
• 实验研究
• 1 材料
• 1.1 药物与试剂
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验动物
• 2 方法
• 2.1 细胞原代培养
• 2.2 细胞传代培养
• 2.3 细胞增殖实验（CCK-8 法）
• 2.4 细胞分化实验（ALP 检测）
• 2.5 钙化功能检测（茜素红染色法）
• 2.6 流式细胞仪检测细胞周期
• 2.7 Elisa 检测细胞的cGMP 含量
• 2.8 siRNA PKGⅡ实验
• 2.9 RT-PCR
• 2.10 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 FA 的有效浓度范围
• 3.2 所选浓度对细胞增殖的影响
• 3.3 所选浓度对细胞分化的影响
• 3.4 流式细胞术检测细胞周期
• 3.5 钙化功能检测
• 3.6 骨形成相关基因的表达
• 3.7 Elisa 检测cGMP 的分泌
• 3.8 PKG 基因的表达
• 3.9 ENaC 基因的表达
• 3.10 siRNA PKGⅡ实验
• 4 讨论
• 4.1 FA 作用于Ob 的有效浓度范围
• 4.2 FA 对Ob 骨形成功能的影响
• 4.3 FA 对Ob 的作用机制的探讨
• 5 结论与展望
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 攻读学位期间完成论文、申请专利及参与科研情况
• 英文缩略表
• 致谢