Netrin-1调控缺氧诱导肝癌细胞上皮间质转化的实验研究

论文摘要

目的肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，容易早期发生侵袭转移，这也是其术后复发、疗效差的主要原因。肿瘤微环境（包括氧浓度、细胞外基质、免疫细胞、间质细胞等）是影响肿瘤转移的重要因素，其中缺氧是许多恶性肿瘤（如肝癌、前列腺癌，胰腺癌等）微环境的一个显著特点，缺氧越严重提示肿瘤的预后越差。癌细胞主要通过上皮间质转化获得侵袭能力，进而突破基底膜发生转移。本课题在研究缺氧对肝癌细胞EMT的诱导作用的基础上，进一步研究缺氧环境中Netrin-1促进肝癌细胞EMT的作用，并对其下游作用机制进行了深入探讨。方法通过1％O2低氧培养建立人肝癌细胞物理缺氧模型，缺氧条件下无血清培养72小时，倒置显微镜观测肝癌细胞在缺氧条件下的形态改变，应用Western blot方法检测上皮细胞标志蛋白E-cadherin、间质细胞标志蛋白Vimentin的表达变化，罗丹明标记的鬼笔环肽检测细胞内骨架重组，用Transwell检测缺氧肝癌细胞迁移、侵袭能力。ELISA检测缺氧肝癌细胞分泌的Netrin-1，免疫荧光检测Netrin-1在缺氧肝细胞中的表达。构建针对Netrin-1 mRNA的干扰质粒pshRNA-Netrin-1及阴性对照质粒pGensil-2，测序鉴定重组体。干扰质粒转染肝癌细胞细胞，G418筛选稳定转染细胞株，RT-PCR和Western blot检测Netrin-1表达的变化。缺氧条件下检测转染肝癌细胞形态改变、标志蛋白蛋白改变和功能改变。构建Netrin-1真核表达质粒，酶切鉴定，G418筛选稳定转染细胞株。观测过表达Netrin-1对肝癌细胞形态和迁移、侵袭能力的影响。同时给予Netrin-1蛋白作用肝癌细胞观测其对肝癌细胞形态和迁移、侵袭能力的影响。免疫荧光观测p-Akt在缺氧肝癌细胞中的表达，Western blot检测缺氧条件下PI3K／Akt通路信号分子的表达，观测PI3K抑制剂LY294002对缺氧诱导肝癌细胞EMT的影响。结果在缺氧条件下，肝癌细胞由连接紧密的上皮样变成连接松散的纺锤体样，胞体狭长，细胞分散，失去细胞间连接。Western blot结果显示，缺氧条件下E-cadherin表达下降甚至消失，Vimentin表达显著增加。鬼笔环肽检测显示，常氧条件下细胞包内F-actin主要位于细胞周边，可见纤细的中间丝，缺氧培养后可见F-actin骨架重组，细胞周边的F-actin重新排列成较粗的中间丝（紧张丝），紧张丝在细胞内平行排列拉伸细胞形态。细胞迁移实验结果显示，缺氧显著促进HepG2细胞迁移能力（P＜0.01），侵袭实验结果与迁移实验结果一致。肝癌细胞稳定转染pshRNA-Netrin-1后，Netrin-1表达显著下降，抑制率达72.79％％±5.11％。转染pshRNA-Netrin-1肝癌细胞显著抑制缺氧诱导肝癌细胞形态改变，同时抑制Vimentin表达，增加E-cadherin表达，对缺氧促进肝癌细胞迁移能力有显著抑制作用，透膜细胞数（314±21）个较对照组（386±23）个显著降低（P＜0.05），侵袭实验结果与迁移实验结果一致。常氧条件下，转染Netrin-1真核表达质粒和用500ng／ml Netrin-1作用肝癌细胞，都观测到细胞形态，呈纺锤体样，细胞迁移、侵袭能力显著增加。PI3K／Akt信号通路在缺氧条件下激活，p-Akt、NF-κB、Twist表达显著增加，在LY 294002的作用下，缺氧诱导的细胞形态改变和E-cadherin减少均受显著抑制，LY 294002抑制PI3K信号能阻断缺氧诱导的肝癌细胞EMT。结论缺氧环境中，Netrin-1激活PI3K／Akt信号通路进而诱导肝癌细胞上皮间质转化，可能促进肝癌的侵袭转移。深入研究Netrin-1作用的分子机制和体内对侵袭转移的影响，可能为抑制肝癌转移的治疗提供实验依据。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 缺氧诱导肝癌细胞上皮间质转化
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 Netrin-1在缺氧诱导肝癌细胞EMT中的作用
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 常氧条件Netrin-1对肝癌细胞EMT的促进作用
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四部分 Netrin-1调控肝癌细胞EMT的分子机制
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 综述 上皮间质转化在肿瘤进展过程中的作用
• 附录1:实验中所使用的主要仪器及试剂配制
• 附录2:攻读期间发表的论文及获奖情况
• 致谢