连续PCR扩增过程中异常现象的发生机理研究

论文摘要

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术从其发明以来,因为其操作的简单方便和高效率而在生物学研究的各个领域得到了广泛的应用,包括序列扩增、序列的人工突变、疾病诊断、法医学鉴定、基因的表达分析等等。从PCR技术发明以来,如何提高反应的特异性和反应的效率一直是人们所共同关心的题目,为此也发展了相当数量的各种方法,如热启动PCR、降落PCR、巢式PCR以及在反应体系中添加一些有益的附属物等。而适合不同目的的PCR技术也得到了充分的发展,如多重PCR、反转录PCR、定量PCR、原位PCR、PCR突变、毛细管PCR技术等等。并且,包括随机引物扩增多态、扩增片段长度多态性、简单重复序列多态性、单核苷酸多态性等这些在PCR技术基础上发展而来的各种分子标记技术极大地方便了遗传分析和遗传图谱的构建等工作。在PCR技术发明了20年后的今天,提高PCR的反应性能、发展适合新领域的PCR技术和新的分子标记技术仍然是研究者关心的题目和努力的方向。PCR实验中已经观察到多种异常现象,除了常见的扩增失败(没有产物)、扩增产物特异性不强(有非特异产物出现)、引物多聚体产物扩增、扩增效率低等现象以外,还包括PCR介导的重组、跳跃、复制滑动等等。阐明这些异常现象的发生机理和过程,避免或缓解这些异常现象在扩增过程中对目的产物扩增的影响,以及促进和利用一些特殊的异常PCR扩增都是PCR技术研究所关心的话题。各种研究工作中经常需要扩增一些长片段的序列,但是在进行长片段PCR时经常会发现扩增目标序列的长度是有限的、扩增效率比较低、扩增产物检测中有很强的背景弥散等现象;同时长片段PCR需要一些特殊的反应体系组成和反应条件。如何更加有效地实现更长序列的PCR扩增也是人们所关心的话题之一。常见的PCR产物重复扩增(以上一轮扩增产物为模板进行新的PCR扩增)扩

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第1章 核酸扩增技术的发展历史和应用
• 1.1 PCR 技术的发展
• 1.2 PCR 技术的应用
• 1.3 基于 PCR 的分子生物学标记方法
• 第2章 PCR（Polymerase Chain Reaction）反应的关键和存在的问题
• 2.1 核酸聚合酶
• 2.2 引物及巢式PCR（Nested primer PCR）
• 2.3 PCR 反应体系中的非必须成分——助变性剂的使用
• 2.4 PCR 反应程序与降落PCR（Touch down PCR）和热启动PCR（Hot-start PCR）
• 2.5 PCR 反应进行的环境——PCR 热循环仪
• 2.6 PCR 实验中常见的异常现象
• 2.7 PCR 反应中的污染
• 2.8 本研究的背景及意义
• 第3章 多次重复 PCR 扩增的最终必然结果
• 3.1 实验材料和方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 185 rDNA 序列的连续扩增结果
• 3.2.2 Plasmid （T Easy Vector）序列的连续扩增结果
• 3.2.3 Bacteriophage λ DNA 序列的连续扩增结果
• 3.3 讨论
• 第4章 重复扩增异常产物——样孔带的组成和性质
• 4.1 实验材料和方法
• 4.1.1 51 Nuclease 处理
• 4.1.2 限制性内切酶分析
• 4.1.3 甲酰胺辅助变性复性分析
• 4.1.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析
• 4.1.5 变性琼脂糖电泳分析
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 51 Nuclease 处理
• 4.2.2 限制性内切酶分析
• 4.2.3 甲酰胺辅助变性复性分析
• 4.2.4 变性PAGE 分析
• 4.2.5 变性琼脂糖电泳分析
• 4.3 讨论
• 第5章 样孔带的产生机理
• 5.1 实验材料和方法
• 5.1.1 引物浓度和扩增循环数与样孔带
• 5.1.2 DNA 聚合酶、引物浓度与样孔带
• 5.1.3 不对称 PCR 和单引物-互补引物PCR
• 5.1.4 巢式 PCR（Nested PCR）
• 5.1.5 PCR 动力学模拟和程序调整
• 5.1.6 复杂产物的模拟——DNase I、限制性内切酶处理
• 5.1.7 复杂产物的模拟——非全长片段对扩增的影响
• 5.1.8 热循环对模板的剪切
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 引物浓度和扩增循环数与样孔带
• 5.2.2 DNA 聚合酶、引物浓度与样孔带
• 5.2.3 不对称 PCR 和单引物-互补引物 PCR
• 5.2.4 巢式 PCR （Nested PCR）
• 5.2.5 PCR 动力学模拟和程序调整
• 5.2.6 复杂产物的模拟——DNase I、限制性内切酶处理
• 5.2.7 复杂产物的模拟——非全长片段对扩增的影响
• 5.2.8 热循环对模板的剪切
• 5.3 讨论
• 第6章 结论及意义
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 在读期间发表文章情况