构建HPV16转基因植物双元载体及转基因植物的生殖安全评估

论文摘要

目的构建HPV16E6.E7植物双元转化载体用于转化番茄,为研发粘膜免疫疫苗建立基础。以小鼠为模型,研究转基因大豆对生殖系统的毒理作用,评估转基因食品安全性。方法通过NCBI查询,使用Vector NTI 8.0软件分析并设计密码子优化的HPV16型E6、E7基因的序列,并引入KOZAK序列和SEKDEL内质网滞留六肽及LTB分子佐剂。重叠PCR人工合成目的基因,PCR及测序鉴定后将目的基因酶切后克隆到含有Cre/lox重组系统的pX6双元载体中,构建四个番茄转化载体pX6-LTB-E6-E7, pX6-LTB-E7-E6,pX6-LTB-E6和pX6-LTB-E7。以含有5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因（EPSPS）的转基因大豆喂食雄鼠,以非转基因大豆为对照,喂食120天后提取小鼠睾丸组织基因组,用PCR扩增技术检测睾丸组织中是否存在外源基因：石蜡切片检测睾丸组织,流式细胞术检测不同分裂期的精细胞数量和彗星电泳检测精子细胞的染色质完整性,评估转基因食品对雄鼠生殖系统的安全性。结果成功地人工合成了优化的目的基因,并构建pX6-LTB-E6-E7,pX6-LTB-E7-E6, pX6-LTB-E6,pX6-LTB-E7番茄转化载体。PCR检测喂食转基因大豆的小鼠睾丸组织基因组未发现转基因大豆中的外源基因,与对照组相比石蜡切片经HE染色后在显微镜下观察并未检测到有病理性损伤,流式细胞术检测不同分裂期的精细胞与对照组并无显著性差异,彗星电泳检测喂食组小鼠精子染色质完整性程度并无差异。结论通过重叠PCR技术获得优化全新基因,构建四个转化载体。以雄鼠睾丸为靶器官,进行转基因食品的生殖毒理学的安全评估未发现转基因植物喂食对其产生生殖毒理效应。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 人乳头瘤病毒的致病机理与研究现状
• 1.2 转基因植物的研究及其在疫苗研究中的应用
• 1.3 转基因植物的安全性评估
• 1.4 本论文的研究目的及意义
• 第二章 HPV16可食用疫苗的设计及载体构建
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料、试剂和仪器
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.3 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 生物信息学分析
• 2.3.2 重叠PCR合成LTB与E6，E7融合基因
• 2.3.3 目的片段的pMD19-T载体构建及酶切目的片段
• 2.3.4 构建双元载体
• 2.4 实验结果与分析
• 2.4.1 生物信息学分析结果
• 2.4.2 LTB基因扩增
• 2.4.3 构建融合基因
• 2.4.4 重叠PCR扩增E6、E7基因
• 2.4.5 利用重叠PCR技术合成融合基因
• 2.4.6 融合基因T载体双酶切鉴定
• 2.4.7 双元转化载体的构建及鉴定
• 2.5 讨论
• 2.6 展望
• 第三章 转基因大豆对雄鼠生殖系统的影响
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料、试剂和仪器
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 实验试剂
• 3.2.3 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 实验设计
• 3.3.2 小鼠睾丸基因组提取及基因检测
• 3.3.3 石蜡切片制作
• 3.3.4 流式细胞术检测
• 3.3.5 彗星电泳
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 小鼠外源基因的检测
• 3.4.2 睾丸组织石蜡切片的组织观察
• 3.4.3 睾丸生精细胞的数量分析
• 3.4.4 精子染色质完整性
• 3.5 讨论
• 3.6 展望
• 参考文献
• 附录
• 硕士研究生期间发表的论文
• 致谢