苍蝇抗菌肽SK84的表纯化及其结构和功能的初步研究

论文摘要

抗菌肽是生物体自身产生的具有抑杀微生物效果的活性肽，两亲性的α螺旋结构为其发挥抗菌作用提供了重要基础。与抗生素相比，抗菌肽抗菌谱广、不易引发耐药性，因而有望被开发为抗微生物感染的新型药物。SK84是陆婕博士于2006年从蝇蛆中鉴定的一种新型抗菌肽，研究发现，SK84能裂解细胞膜，对部分革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等有杀伤作用，并且能够抑制肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231等的增殖。SK84在天然产物中含量很少，分离纯化困难，而化学合成成本较高，因而限制了对其功能与作用机制的研究。本课题建立了一种新的SK84生产方法，并对获得的蛋白进行了功能和结构的初步研究，主要结果如下：1)构建了重组质粒pET-32a（+）-SK84-His6，并在大肠杆菌中获得成功表达。2)优化了诱导表达条件，最佳条件为：初始菌液OD值，1.0；IPTG浓度，1.0mM；温度，30℃；诱导时间，4h。3)活性研究发现，表达的SK84对枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌有一定的抑制作用，并促进HepG2细胞的凋亡。4)检测了重组表达蛋白SK84-His6的二级结构，发现SK84-His6可以形成两亲性的α螺旋结构。综上所述，通过原核表达可以获得具有一定活性的高纯度的SK84蛋白，此方法提供了一种新的SK84获取途径，为今后的进一步研究奠定了良好基础。此外，结构分析的结果提示，SK84可能通过两亲性的α螺旋结构发挥抗菌作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 概论
• 1.1 抗菌肽的简介
• 1.2 抗菌肽的功能与作用机理
• 1.3 苍蝇抗菌肽 SK84
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.2 常用溶液的配制
• 2.3 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 重组质粒 pET-32a+-SK84-His6 的构建
• 3.2 融合蛋白 SK84-His6 的表达与纯化
• 3.3 融合蛋白 SK84-His6 诱导表达条件的优化
• 3.4 融合蛋白 SK84-His6 的抗菌活性
• 3.5 融合蛋白 SK84-His6 对 HepG2 细胞凋亡的影响
• 3.6 融合蛋白 SK84-His6 的二级结构分析
• 4 讨论
• 4.1 SK84-His 蛋白的结构与功能
• 4.2 选择大肠杆菌原核表达系统的可行性
• 5 总结
• 5.1 本研究获得的结果
• 5.2 值得进一步开展的工作
• 致谢
• 参考文献
• 附录 1 在攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 附录 2 文中所用缩写
• 附录 3 蛋白质 SK84-His6 的二级结构预测结果