血管瘤型J亚群禽白血病病毒全基因组核酸序列分析及gp85基因的原核表达

论文摘要

J亚群禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus Subgroup J, ALV-J）属于反转录病毒,能够诱发本地鸡和野生禽类产生肿瘤、生长迟缓、免疫抑制等,给养禽业带来了巨大的经济损失和严重威胁。J亚群禽白血病病毒自1989年由英国学者分离鉴定出以来,主要引起肉鸡的骨髓瘤白血病,但近年来,以往曾研究证实不易发生肿瘤的中国商品代蛋鸡和地方种鸡受到ALV-J感染后也能诱导产生较高的肿瘤发生率。此外,以往少见的由ALV-J引发的血管瘤病例近几年逐渐增多。这足以表现出不同地域ALV-J感染的特殊性和复杂性。本研究通过接种鸡胚成纤维细胞（CEF）RT-PCR及PCR检测技术,首次从四川某祖代种鸡场患病鸡中分离鉴定出一株血管瘤型J亚群禽白血病病毒,命名为SCDY1.以分离株SCDY1感染的CEF基因组DNA作为扩增其前病毒基因组模板,根据已公布的原型毒株HPRS-103序列设计合成9对引物,经PCR扩增出9段连续的、部分相互重叠的DNA片段,然后分别连入pMD19-T载体进行克隆并测序。经软件分析,ALV-J分离株SCDY1的前病毒全基因组核苷酸序列最终完成。禽白血病病毒的亚型主要是由病毒膜表面糖蛋白gp85决定的,根据SCDY1病毒株全基因组测序中gp85基因的测序结果,利用Primer permier 5.0设计一对表达引物,用于扩增gp85基因并构建原核表达载体PET-32a（+）/gp85,在大肠杆菌Rosetta中进行表达。结果表明,SCDYl;株cDNA基因组全长7489 bp。将该序列与GeneBank公布的其它ALV-J毒株全基因组序列进行同源比较,SCDY1株基因组的gag和pol基因相对保守,env基因变异性相对较大。在核苷酸水平上,gag、pol和env基因的同源性分别为94.3-96.5%,96.6-97.6%,90.3-94.2%；在氨基酸水平上,gag、pol和env的同源性分别为96.2-98.4%,97.4-98.7%,85.1-90.7%。SCDYl株E元件和non-functional TM序列几乎完全缺失,在3’UTR的U3区也出现了11个连续核苷酸序列的缺失。U3区转录调控元件分析表明,SCDYl:株U3区11 bp的缺失序列位于调控元件CArGbox的上游,类似于人类基因Apo-AI的转录因子ABI REP1,它可以为HNF-4提供结合位点,与之相结合,而HNF-4又可以作为一种阻遏子,在真核基因调控中起重要作用。此外,构建的原核表达系统成功获得了血管瘤型ALV-J病毒株的gp85蛋白,该蛋白的分子量约为57KD,与预计相符。表达的目的蛋白以包涵体的形式存在于菌体蛋白中。经Western-blot分析表明,该表达产物具有良好的反应原性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 目录
• 第一部分 前言
• 1 病原学
• 1.1 生物学分类地位
• 1.2 病毒粒子结构
• 1.3 基因组结构
• 1.4 病毒稳定性
• 1.5 病毒的培养特性
• 1.6 病毒的致病性
• 1.7 病毒致肿瘤机制
• 2 ALV-J流行病学
• 3 ALV-J临床症状
• 4 ALV-J的鉴别和诊断
• 4.1 ALV-J的分离与鉴定
• 4.2 ALV-J单克隆抗体的应用
• 4.3 ALV-J的PCR检测
• 5 ALV-J的防治
• 6 研究的目的和意义
• 第二部分 试验研究
• 第一章 血管瘤型J亚群禽白血病病毒四川株SCDY1全基因组核酸序列分析
• 1 材料
• 1.1 病料与细胞
• 1.2 菌株与载体
• 1.3 试验试剂
• 1.3.1 主要试剂
• 1.3.2 常用试剂的配制
• 1.4 主要试验仪器
• 1.5 引物的设计
• 2 试验方法
• 2.1 病毒的分离与鉴定
• 2.1.1 病毒的分离
• 2.1.2 病毒的鉴定
• 2.2 SCDY1全基因组核酸序列的测定
• 2.2.1 SCDY1全基因组核酸序列的PCR扩增
• 2.2.2 SCDY1 cDNA末端序列的扩增
• 2.2.3 胶回收
• 2.2.4 各段基因的TA克隆
• 2.2.5 重组质粒的转化
• 2.2.6 重组质粒的筛选和鉴定
• 2.3 SCDY1分离株全基因组的遗传变异分析
• 3 试验结果
• 3.1 病毒分离与鉴定
• 3.1.1 PCR扩增结果
• 3.1.2 RT-PCR扩增结果
• 3.2 SCDY1全基因纰核酸序列测定结果
• 3.2.1 全基因PCR扩增结果
• 3.2.2 全基因各段基因双酶切鉴定结果
• 3.2.3 SCDY1毒株全基因组核苷酸序列的建立
• 3.3 SCDY1前病毒cDNA全基因组序列与已知ALV-J毒株相应序列的同源性比较
• 3.3.1 结构基因gag、pol和env的比较
• 3.3.2 LTR区段的比较
• 3.3.3 3’UTR分析
• 3.3.4 U3区潜在转录因子结合位点分析
• 3.3.5 前病毒cDNA全序列遗传进化分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二章 血管瘤型J亚群禽白血病病毒SCDY1株gp85基因的原核表达
• 1 材料
• 1.1 毒株、菌株及载体
• 1.2 主要试剂
• 1.3 试验仪器
• 1.4 试剂配制
• 1.4.1 基因表达相关试剂
• 1.4.2 蛋白纯化及鉴定相关试剂
• 2 方法
• 2.1 gp85基因的生物信息学分析
• 2.2 引物的设计
• 2.3 原核表达载体的构建
• 2.3.1 重组质粒的抽提与Rosetta（DE3）感受态细胞的制备
• 2.3.2 带粘性末端的gp85基因与pET-32a（+）载体的酶切
• 2.3.3 连接、转化及鉴定
• 2.4 pET-32-gp85的表达
• 2.4.1 重组质粒pET-32-gp85的表达
• 2.4.2 SDS-PAGE鉴定
• 2.4.3 表达条件的筛选优化
• 2.4.4 表达产物的初步纯化
• 2.5 Western-blot分析
• 3 结果
• 3.1 gp85基因的生物信息学分析
• 3.2 gp85蛋白表达载体的构建
• 3.3 pET-32-gp85的表达
• 3.3.1 表达条件的优化
• 3.3.2 重组表达蛋白初步纯化结果
• 3.4 表达蛋白Westem-blot分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文