巴西橡胶树体胚发生的改良及乳管分化研究

论文摘要

巴西橡胶树属大戟科橡胶属,是多年生的异花授粉乔木,在热带地区广泛种植。其所产的天然橡胶是四大工业原料之一,也是重要的战略物资,在国民经济中占有举足轻重的地位。巴西橡胶树花药培养是其遗传改良的重要技术手段,但体胚发生频率低是制约其组培苗工厂化生产和构建遗传转化体系的主要因素。本研究主要围绕如何改良巴西橡胶树花药体胚发生来开展一系列工作。我们对影响花药培养体胚发生的内外因素进行深入研究并对其培养条件进行改良；由于游离小孢子培养具有提高胚胎发生的优点,我们尝试在橡胶树开展这方面的工作；转基因技术是遗传改良的重要技术手段,我们克隆了胚胎发生关键基因并转化橡胶树的花药愈伤,以期获得具高体胚发生能力的转基因株系；我们首次发现花药愈伤中存在乳管细胞,探讨花药愈伤乳管细胞分化与体胚发生关系,对改良体胚发生也有一定的意义。上述这些研究的开展,将对提高橡胶树花药体胚发生和改良其花药培养有着重要的意义。本研究所取得的结果如下：（1）首次系统研究了橡胶树花药愈伤的形态特征、组织细胞学区别。橡胶树花药胚性与非胚性愈伤有着明显差别,前者表现为组织疏松脆性,表面凹凸不平,有较多小球状突起,细胞中含有较大的胞核,细胞形状呈规则小圆球形,细胞排列紧密,细胞体积较小；后者存在两种类型,第一种表现为结构紧密,整块组织硬实,表面较平滑,细胞形态不规则,胞质稀少,部分细胞含有极小的胞核,细胞体积大,第二种表现为组织松软、水渍状,细胞不含有胞核,胞质极稀薄并液泡化,细胞形状不规则,细胞排列较疏松,胞间间隙较大,细胞体积较大。同时发现胚性愈伤发生频率与其体胚发生频率呈极显著相关；胚性愈伤在培养后期细胞合成依然保持活跃,细胞分裂依然旺盛,细胞分化力高。首次对橡胶树花药胚性愈伤胚胎发生的生理生化机制进行深入研究。同一品种的胚性愈伤在整个培养过程中淀粉和蛋白质含量均高于非胚性愈伤,在培养后期开始积累淀粉,可能是为体胚发生作准备,为新的发育阶段提供物质和能量。胚性愈伤高含量的蛋白质可能是其体胎发生的关键因素。胚性愈伤中类胡萝卜素含量较高,表明其具有较强的抗氧化能力,使其细胞不易褐化,降低了组织块的褐化程度。高体胚发生频率的品种其胚性愈伤细胞代谢较活跃,分化力较强,从而消耗更多的碳源,同时这种碳源的消耗可能是促进其向胚胎发生的信号。胚性愈伤CAT、SOD的含量与体胚发生频率呈极显著相关,CAT、SOD可能是胚性愈伤体胚发生的基础。（2）对橡胶树花药体胚进行系统分类,共分9种类型；首次发现橡胶树花药体胚发生过程中产生双体胚现象,该类胚能正常发育成植株。对橡胶树花药体胚发生的培养条件进行改良。暗培养诱导胚状体2个月后再转移至500Lux弱光照条件下培养10-15d,然后再转移至出苗培养基培养,能够显著提高植株再生率；稀土具有提高橡胶树花药体胚发生率的效果,诱导胚胎发生培养基中以添加1mgL-’稀土培养效果最佳。（3）对橡胶树游离小孢子培养体系进行初步研究。小孢子的提取采用两种不同的方法进行,结果发现以间接研磨法为佳,虽然工作效率低,但污染率低、杂质少、培养效果好。对小孢子进行不同的预处理试验,发现用Starvation Medium B预处理液预处理小孢子2d有利于小孢子分化。比较两种不同的碳源培养效果,发现麦芽糖培养效果好。对诱导培养基中的pH值、组分进行研究,发现诱导培养基pH值为6.6时,以改良N6为基本培养基添加外源激素2,4-D 0.5 mgL-1、KT 0.5mgL-1诱导效果好,小孢子分化率达8.33%。巴西橡胶树游离小孢子分化依赖基因型,只有海垦2的小孢子具有分化力。小孢子的分化以B途径为主,初步获得小孢子分化的细胞团和微愈伤。同时以橡胶树小孢子为受体进行电激转化试验,瞬时表达结果证明外源基因已导入部分小孢子基因组中。（4）以橡胶树品种海垦2花药愈伤为受体,采用农杆菌介导法将胚胎发生基因BabyBoom转化橡胶树。结果表明：卡那霉素选择压以50mgL-1为最佳；共培养温度对转化效率影响显著,以20℃共培养效果较26℃好；侵染培养35-40d的愈伤转化效率最高,达100%。获得了抗性愈伤和转基因胚状体,经GUS组织化学法和PCR检测,表明外源基因已整合至它们的基因组中,为下一步转基因植株的获得奠定了基础。（5）通过组织化学法和免疫组织化学法首次证明巴西橡胶树花药愈伤中存在乳管细胞,虽然花药愈伤中存在少数的延伸形态的乳管细胞,但大部分表现为非延伸形态,不同于植物中现有的乳管细胞形态。这些非延伸形态的乳管细胞可能是有节乳管早期的原始特征。乳管细胞在花药愈伤中的分化依赖基因型,同时与体胚发生负相关。R107、RRIM600、热研8-79、热研7-33-97较海垦2有着更多的乳管细胞,但体胚发生率均显著低于海垦2。乳管细胞簇在PR107、RRIM600、热研8-79、热研7-33-97的愈伤中存在,但未能在海垦2花药中发现。这表明愈伤组织中的乳管细胞妨碍其体胚发生。如果能通过改良培养条件（激素调控等）来减少愈伤组织中乳管细胞数量,以期提高其体胚发生力,则有可能克服花药培养难题,这可能提供了一个改良橡胶树组织培养的连接点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1.1 巴西橡胶树及其生物技术简介
• 1.2 巴西橡胶树组织培养研究进展
• 1.2.1 花药培养
• 1.2.1.1 花药培养的技术流程
• 1.2.1.2 制约花药再生体系建立的因素
• 1.2.1.3 花药植株的起源
• 1.2.1.4 花药植株的特性
• 1.2.2 内珠被培养
• 1.2.2.1 内珠被来源的胚性愈伤继代培养
• 1.2.2.2 内珠被来源的胚性愈伤组织超低温保存
• 1.2.3 未授粉胚珠培养
• 1.2.4 子房培养
• 1.2.5 茎尖培养
• 1.2.6 花药植株微繁及籽苗芽接
• 1.2.7 次生胚诱导培养
• 1.2.8 悬浮细胞培养
• 1.2.9 原生质体培养
• 1.3 植物游离小孢子培养研究进展
• 1.3.1 游离小孢子培养的意义
• 1.3.2 影响游离小孢子培养的因素
• 1.3.2.1 材料预处理
• 1.3.2.2 小孢子预处理
• 1.3.2.3 供体基因型
• 1.3.2.4 小孢子培养密度
• 1.3.2.5 培养基pH值
• 1.3.2.6 培养基成分
• 1.3.3 植物游离小孢子培养研究概况
• 1.4 植物乳管研究进展
• 1.4.1 乳管的类型及其发育
• 1.4.2 乳管的功能
• 1.4.3 巴西橡胶树乳管细胞的构成及胶乳的成分
• 1.4.3.1 巴西橡胶树乳管细胞的构成
• 1.4.3.2 巴西橡胶树胶乳的成分
• 1.4.4 巴西橡胶树乳管分化研究进展
• 1.4.5 乳管细胞在组织培养物中的分化
• 1.5 本课题的研究目的和意义
• 第二部分 巴西橡胶树花药愈伤形态发生、组织学及其生理生化的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 材料处理
• 2.1.3 花药愈伤组织脱分化生长过程的形态学观察
• 2.1.4 花药愈伤组织学研究
• 2.1.4.1 试剂的配制
• 2.1.4.2 石蜡制片
• 2.1.5 不同类型愈伤的发生频率
• 2.1.6 不同类型愈伤的分化力比较
• 2.1.7 花药愈伤组织的生理生化研究
• 2.1.7.1 可溶性糖和淀粉的测定
• 2.1.7.2 可溶性蛋白的测定
• 2.1.7.3 叶绿素和类胡萝卜素含量的测定
• 2.1.7.4 愈伤组织过氧化氢酶（CAT）的测定
• 2.1.7.5 愈伤组织超氧化物歧化酶（SOD）的测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 花药愈伤的形态类型
• 2.2.2 三种类型花药愈伤的细胞学差异
• 2.2.3 不同品种各种类型愈伤的发生频率及其与体胚发生的相关性
• 2.2.4 三种类型花药愈伤分化力的比较
• 2.2.5 三种类型愈伤生理生化的比较
• 2.2.5.1 三种类型愈伤组织可溶性糖和淀粉含量的比较
• 2.2.5.2 三种类型愈伤组织蛋白质含量的比较
• 2.2.5.3 三种类型愈伤组织叶绿素和类胡萝卜素的比较
• 2.2.6 品种间胚性愈伤组织的生理生化比较
• 2.2.6.1 品种间胚性愈伤组织的可溶性糖和淀粉含量的比较及其与体胚发生相关性的分析
• 2.2.6.2 品种间胚性愈伤组织的蛋白质含量比较及其与体胚发生相关性的分析
• 2.2.6.3 品种间过氧化物酶含量的比较及与体胚发生相关性的分析
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三部分 巴西橡胶树花药体胚发育及其培养条件的改良
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 外植体的消毒
• 3.1.3 愈伤组织的诱导
• 3.1.4 体胚诱导
• 3.1.5 植株诱导
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 花药胚性愈伤组织体胚发育过程及其类型
• 3.2.2 花药胚性愈伤不同类型体胚的发生频率
• 3.2.3 不同胚状体培养条件对植株再生率的影响
• 3.2.4 稀土对花药体胚发生的影响
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 第四部分 巴西橡胶树游离小孢子培养初步研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 培养基及试剂的配制
• 4.1.2.2 雄花预处理的效果
• 4.1.2.3 橡胶树游离小孢子的提取纯化
• 4.1.2.4 预处理对小孢子分化的影响
• 4.1.2.5 诱导培养基组分对小孢子分化的影响
• 4.1.2.6 不同橡胶树品种对小孢子分化的影响
• 4.1.2.7 游离小孢子的电激转化
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 雄花预处理的效果对橡胶树小孢子分化的影响
• 4.2.2 游离小孢子提取方法的比较
• 4.2.3 不同预处理对橡胶树小孢子分化的影响
• 4.2.4 诱导培养基的组分对小孢子分化的影响
• 4.2.5 游离小孢子分化过程
• 4.2.6 不同品种的小孢子培养效果
• 4.2.7 游离小孢子瞬时表达
• 4.3 讨论
• 4.3.1 花药低温预处理对小孢子分化的影响
• 4.3.2 游离小孢子的预处理对小孢子分化的影响
• 4.3.3 碳源对小孢子培养的影响
• 4.3.4 基因型对小孢子培养的影响
• 4.3.5 培养基pH值对小孢子培养的影响
• 4.3.6 林木游离小孢子培养的困难性
• 4.3.7 以游离小孢子为受体构建橡胶树遗传转化的可能性
• 4.4 结论
• 第五部分 胚胎发生基因转化橡胶树的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料的采集与处理
• 5.1.2 BBM基因的克隆与植物表达载体的构建
• 5.1.3 表达载体导入农杆菌和菌液的制备
• 5.1.4 卡那霉素选择压的影响
• 5.1.5 共培养温度的影响
• 5.1.6 不同培养时间的外植体对转化效率的影响
• 5.1.7 抗性愈伤的检测
• 5.1.8 抗性胚状体的诱导
• 5.1.9 转基因胚状体检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 BBM基因克隆和表达载体的构建
• 5.2.2 卡那霉素选择压的影响
• 5.2.3 共培养温度的效果
• 5.2.4 不同培养时间的外植体对转化效率的影响
• 5.2.5 抗性愈伤的检测
• 5.2.6 抗性愈伤诱导转基因胚状体
• 5.3 讨论
• 5.4 结论
• 第六部分 橡胶树花药愈伤乳管细胞的分化及其与体胚发生的关系
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 愈伤组织的诱导
• 6.1.1.1 材料
• 6.1.1.2 材料的处理
• 6.1.2 溴-碘组织化学染色
• 6.1.2.1 试验的配制
• 6.1.2.2 材料的固定
• 6.1.2.3 溴-碘染色和制片
• 6.1.3 石蜡制片的免疫组织学定位
• 6.1.3.1 试剂的配制
• 6.1.3.2 材料的处理
• 6.1.3.3 试验步骤
• 6.1.4 新鲜切片免疫组织学定位
• 6.1.4.1 溶液的配制
• 6.1.4.2 实验步骤
• 6.1.5 不同基因型的花药愈伤组织的诱导
• 6.1.6 不同基因型的体胚发生率
• 6.1.7 不同基因型的愈伤组织中乳管细胞发生率的比较
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 组织化学法定位愈伤乳管细胞
• 6.2.2 石蜡制片免疫组织化学法定位花药愈伤乳管细胞
• 6.2.3 新鲜组织制片免疫组织化学法定位花药愈伤乳管细胞
• 6.2.4 愈伤组织中的乳管细胞分化依赖于橡胶树的基因型
• 6.3 讨论
• 6.3.1 关于植物乳管的鉴定方法
• 6.3.2 关于橡胶树花药愈伤乳管细胞与花药体胚发生的关系
• 6.3.3 关于橡胶树花药愈伤组织作为生物反应器的可能性
• 6.3.4 关于利用橡胶树花药愈伤组织作为一种研究乳管分化机制的模式的可能性
• 6.4 结论
• 参考文献
• 博士期间发表的论文及申请的专利
• 博士期间主持的课题
• 缩略词表
• 致谢