水稻APX与CAT同工酶的功能特性及其与盐胁迫关系的研究

论文题目: 水稻APX与CAT同工酶的功能特性及其与盐胁迫关系的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 园林植物与观赏园艺

作者: 鲁振强

导师: 柳蔘奎

关键词: 水稻,同工酶,抗坏血酸过氧化物酶,过氧化氢酶,盐胁迫,转基因

文献来源: 东北林业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 水稻是全球性重要的粮食作物,由于环境胁迫造成的产量降低、品质下降的损失是惊人的。盐碱等环境胁迫条件下,植物体由于细胞内活性氧的产生增多,引发了活性氧的代谢紊乱,对细胞造成了一系列的毒害。如何有效地清除过多的活性氧,调节活性氧的产生与清除平衡,增强抗氧化酶活性与提高抗氧化代谢水平,最大限度地降低活性氧的毒害作用,已成为当今植物抗性机理研究的一个热点。在本研究中,我们选取了水稻抗氧化系统的关键解毒酶抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase,APX）与过氧化氢酶（catalase,CAT）同工酶,在碳酸盐等胁迫下,对同工酶基因的表达特性、植物体内同工酶的功能特性与盐胁迫的关系进行了比较研究;同时,对同工酶基因的重组蛋白在体外的表达特性,以及转基因植物突变体及其相关生理生化代谢,进行了系统的研究。以期对胁迫下的植物抗性机理进行补充与探索,为提高植物抗逆性的研究提供理论依据。主要获得了以下研究结果: 根据Genbank数据库及水稻基因组序列信息,利用RT-PCR方法,获得了水稻APX同工酶基因APXa、APXb与CAT同工酶基因CAT1、CAT2的功能区片段。两个APX同工酶基因推定的氨基酸序列的相似性为92%,预测定位于微体过氧化物体的可能性分别为47.4%和50.8%;定位于细胞质的可能性都为45%。CAT同工酶基因推定的氨基酸序列的相似性分别为76.4%,预测定位于微体过氧化物体的可能性分别为74.8%、64%;定位于细胞质的可能性为45%。在80mM NaCl,30mM NaHCO3,15mM Na2CO3,10%PEG,15mM H2O2等胁迫条件下,基因表达结果显示:APX同工酶基因在叶与根中均可表达,表达上既有相似趋势又有细微差异:与对照相比,APXa、APXb在叶中以80mM NaCl处理表达量最高:APXb在根中的30mM NaHCO3,15mM Na2CO3处理时表达量高于80mM NaCl的处理,以15mM H2O2的表达量最高,均强于对照水平,此特点与APXa存在不同;APX同工酶基因受到胁迫时表现出各自的特性。CAT同工酶基因受到胁迫诱导而表达量显著增加,在叶中的表达均高于根;CAT1与CAT2存在较细微的表达差异:CAT1在叶中以15mM H2O2的表达量最高,在根中的各处理中表达量相似:CAT2在根与叶中,均表现以80mM NaCl、15mM Na2CO3和15mM H2O2处理的表达量较高。 结合同工酶基因的差异表达特性,我们在活性蛋白质水平上对水稻体内APX、CAT同工酶的表达特性与上述盐胁迫的关系进行了研究。酶活性结果显示,APX总活性由于盐胁迫而缓慢升高,CAT活性受胁迫呈波动变化趋势,酶活性在叶片与根中存在差异。APX、CAT同工酶的酶谱分析进一步揭示了酶活性与上述盐胁迫的关系,至少有五种,APX同工酶被检测到,并且有新谱带在处理的48hr后样本中出现:三种CAT同工酶谱带被检测到;叶片中的酶谱种类多于根中;胁迫处理下,水稻组织中的H2O2含量表现波动的变化趋势;抗坏血酸含量表现出增加的趋势,与酶活性呈正相关。本研究结果,显示出水稻APX与CAT同工酶在胁迫胁迫下的差异表达特征。 为进一步阐明水稻APXa与APXb同工酶的酶学特性,采用蛋白质重组技术,将水

论文目录:

摘要

Abstract

1 绪论(文献综述)

1.1 氧化胁迫与活性氧代谢

1.1.1 活性氧种类

1.1.2 活性氧产生及相互转化

1.1.3 活性氧产生的场所

1.1.4 活性氧检测

1.1.5 活性氧危害

1.1.6 活性氧的积极作用

1.2 活性氧的清除

1.2.1 非酶类抗氧化剂

1.2.2 抗氧化解毒酶

1.3 抗坏血酸过氧化物酶(APX,EC1.11.1.11)

1.4 过氧化氢酶(CAT,EC1.11.1.6)

1.5 植物抗氧化胁迫基因工程研究进展

1.6 本研究的目的与意义

2 胁迫条件下水稻APX和CAT同工酶基因表达特性的比较研究

2.1 材料与方法

2.1.1 试验材料与试剂

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 水稻APX与CAT同工酶基因功能区片段的获得

2.2.2 目的基因的氨基酸序列相似性的比较及细胞内定位预测

2.2.3 胁迫条件下APX、CAT同工酶基因的mRNA表达特性

2.3 讨论

2.4 本章小结

3 水稻APX和CAT同工酶与几种胁迫关系的比较研究

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 胁迫处理的适宜强度的确定

3.2.2 水稻APX、CAT同工酶活性电泳分析

3.2.3 胁迫下水稻H_2O_2解毒酶的酶活性分析

3.2.4 H_2O_2代谢与胁迫的关系分析

3.2.5 胁迫下抗坏血酸含量的变化分析

3.3 讨论

3.4 本章小结

4 水稻APX与CAT同工酶基因的重组蛋白在E.coli中的表达纯化与特性研究

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 原核表达载体的构建及鉴定

4.2.2 重组融合蛋白在E.coli中的的表达

4.2.3 融合蛋白的纯化

4.2.4 GST-APXa、GST-APXb融合蛋白的酶动力学特性比较分析

4.3 本章小结

5 水稻APX与CAT同工酶基因在烟草中的表达及盐胁迫下相关生理代谢的研究

5.1 材料与方法

5.1.1 试验材料及试剂

5.1.2 方法

5.2 结果与分析

5.2.1 植物表达载体的构建及鉴定

5.2.2 植物表达载体的农杆菌转化及鉴定

5.2.3 烟草的遗传转化

5.2.4 转基因烟草植株的分子鉴定

5.2.5 转基因烟草植株的转录表达分析

5.2.6 转基因烟草植株的同工酶分析

5.2.7 转基因烟草的酶活性分析

5.2.8 盐胁迫下转基因烟草植株H_2O_2含量的变化

5.2.9 转基因烟草植株的抗盐性分析

5.3 讨论

5.4 本章小结

结论

参考文献

附录：本文缩略词表

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

发布时间: 2005-10-21

参考文献

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