成体小鼠胰腺单细胞的离体分离、分析及培养

论文摘要

糖尿病在世界范围内的发病率逐年上升,目前尚没有彻底根治的医疗手段,胰岛移植是有效治疗糖尿病的方法,但存在供体缺乏问题。胰腺干细胞是目前最有希望的胰岛细胞来源,然而由于胰腺是一个较为特殊的消化器官,现有分离方法都不能理想地分散胰腺组织获得大量胰腺单细胞。因而,如何高效分离获得分散的胰腺单细胞悬液并富集胰腺干细胞是本研究的目标。本研究尝试利用胶原酶和胰酶在不同条件下分离小鼠胰腺组织,摸索建立胰腺单细胞悬液的最佳制备方法；通过探索胰酶消化的时间,得到分离胰腺组织的最佳消化条件；通过流式细胞术对分离得到的小鼠胰腺单细胞悬液进行分析,探索其在胰腺细胞分析和分选方面的应用；通过将分离得到的小鼠胰腺单细胞在离体情况下进行增殖培养,筛选具有较强增殖能力的干／祖细胞群；通过将分离得到的胰腺单细胞悬液进行混杂培养,诱导其形成胰岛样的细胞团。结果显示：与胶原酶37℃温消化以及胶原酶胰蛋白酶联合温消化法比较,胰酶冷消化法分离得到细胞悬液的单细胞比率达到95%以上,远远高于胶原酶消化的60%-70%以及联合消化法的86%-89%；胰酶冷消化14～18小时,平均每克组织得到2.53-2.63x107细胞,较胶原酶消化（1.21x107）及联合温消化（2.14x107）的细胞得率显著提高；胰蛋白酶冷消化法分离细胞活性为87.82%～89.34%,远高于胶原酶温消化（65.66%）以及联合消化法（49.66%）；将冷消化分离得到的胰腺单细胞进行流式细胞分析,通过Brdu、DBA、Bcrp1等分子标记的检测发现,冷消化获得细胞比例与活体情况相似,而且实验重复结果稳定；在离体培养研究中发现,冷消化分离得到的这群细胞中能够筛选得到具有较强增殖能力的细胞集落,在混杂培养的条件下,还能够形成DTZ染色阳性的胰岛样细胞团。上述结果表明,胰蛋白酶冷消化法是一种适用于小鼠成体胰腺组织的分离方法,通过这种方法能够高效制备小鼠胰腺单细胞悬液,为胰腺干细胞的研究奠定了基础,同时还为今后利用胰腺干细胞治疗糖尿病等胰腺疾病提供了准备条件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 胰腺
• 1.1.1 胰腺的结构
• 1.1.1.1 外分泌部
• 1.1.1.2 内分泌部
• 1.1.2 胰腺的发育
• 1.2 胰腺疾病及损伤的治疗及研究进展
• 1.2.1 糖尿病的概述
• 1.2.2 胰腺疾病的胰腺干细胞治疗
• 1.2.2.1 成体胰腺干细胞治疗糖尿病
• 1.2.2.2 胰腺干细胞与胰腺肿瘤及胰腺损伤
• 1.3 胰腺单细胞的分离制备
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 胰腺单细胞悬液的高效制备方法
• 2.1 试验材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.1.1 试验动物
• 2.1.1.2 试验试剂
• 2.1.1.3 主要仪器设备
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 试验用品的清洗和灭菌
• 2.1.2.2 实验所需溶液的配制及试剂分装
• 2.1.2.3 小鼠胰腺单细胞悬液的高效制备
• 2.1.2.4 细胞计数及用台盼蓝进行细胞活力测定
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 胶原酶温消化法分离小鼠胰腺单细胞
• 2.2.2 胰酶及胶原酶混合温消化法分离小鼠胰腺单细胞
• 2.2.3 胰酶-EDTA冷消化法分离制备小鼠胰腺单细胞悬液
• 2.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 3 小鼠胰腺单细胞的流式细胞分析
• 3.1 试验材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.1.1 试验动物
• 3.1.1.2 试验试剂
• 3.1.1.3 主要仪器设备
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 主要溶液的配制及试剂分装
• 3.1.2.2 对小鼠进行Brdu的标记
• 3.1.2.3 流式细胞分析胰酶冷消化法分离制备的小鼠胰腺单细胞悬液
• 3.2 实验结果
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 4 小鼠胰腺细胞的离体培养分析
• 4.1 试验材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.1.1 试验动物
• 4.1.1.2 试验试剂
• 4.1.1.3 主要仪器设备
• 4.1.2 试验方法
• 4.1.2.1 主要溶液的配制及试剂分装
• 4.1.2.2 胰蛋白酶冷消化法分离得到的小鼠胰腺细胞的离体培养
• 4.1.2.3 胰蛋白酶冷消化法分离得到的小鼠胰腺单细胞的离体诱导培养
• 4.1.2.4 DTZ（双硫腙）染色
• 4.2 实验结果
• 4.2.1
• 4.2.1.1 胰蛋白酶冷消化法分离得到的小鼠胰腺细胞的离体增殖培养
• 4.2.1.2 胰蛋白酶冷消化法分离得到的小鼠胰腺单细胞的离体诱导培养
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢