苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520基因组中TA系统的研究

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株YBT-1520的全基因组测序结果表明它含有1条染色体和11个质粒。毒素抗毒素系统（TA系统）最初是在大肠杆菌的低拷贝大质粒上发现的,此后的研究多集中于G-细菌的大质粒上,对G+的质粒尤其是小质粒的研究非常少。本研究从NCBI数据库中收集了562条毒素或者抗毒素蛋白质的序列,通过穷举比对在YBT-1520基因组上发现了多种TA系统。1.质粒pBMB8240上潜在TA系统kyAB的研究本研究在YBT-1520菌株中发现了新质粒pBMB8240上有两个邻近的开放读码框,分别命名为KyA和KyB蛋白,通过序列分析,发现KyA和KyB分别与已知抗毒素、毒素蛋白有序列一致性。KyA和kyB基因的克隆实验表明kyA基因很容易克隆;而多次努力克隆到的kyB基因区域都发生了基因突变。KyAB系统装载到不稳定的载体pBMB0631上去之后发现重组质粒的稳定性大大升高。以上结果表明kyAB系统是一个潜在的TA系统,并且能够增强不稳定质粒的稳定性。这是第一个克隆到大肠杆菌中的来自苏云金芽胞杆菌的质粒TA系统。2.质粒pBMB7635上潜在TA系统kyCD的研究本研究发现YBT-1520中的质粒pBMB7635与本实验室以前克隆的质粒pBMB9741有很高的相似性,对pBMB7635重新测序,并将质粒pBMB9741重新命名为pBMB7635。质粒pBMB7635上有两个邻近的开放读码框,与已经鉴定的TA系统有较高相似性,将这两个分别编码94和133个氨基酸大小的蛋白质分别命名为KyC和KyD蛋白。KyC、kyD和kyCD系统及临近区域的克隆实验表明kyC基因很容易克隆;而多次努力克隆kyD基因和kyCD系统及临近区域只得到少量转化子,而且这些转化子中kyD区域都发生了基因突变,表明kyCD很可能是TA系统,且不能在大肠杆菌中克隆。3.质粒pBMB2062的克隆和分析克隆并分析了菌株YBT-1520中的多拷贝小质粒pBMB2062,序列分析表明,pBMB2062含有2个ORFs（大于75个氨基酸）,缺失实验证明ORF1（289aa）对于质粒在芽胞杆菌中的复制和稳定是必需的,ORF2则不是。研究随机选取了7个不同血清型菌株的小质粒进行了克隆和测序,发现这些小质粒的序列高度保守。斑点杂交实验表明该质粒在目前鉴定的84个Bt血清型菌株中的分布为41%。4.YBT-1520染色体上mazEF系统的克隆和分析在YBT-1520染色体上找到一对mazEF系统,本实验对mazEF系统进行了敲除突变,改变MazEF的表达水平来探索MazEF的表达与PCD之间的的相互作用,从而进一步研究mazEF的功能。研究发现,敲除了mazEF系统的菌株在45℃培养4天之后,菌体量逐渐减少,取样镜检发现菌体大部分死亡。从另外一个角度证明了染色体上的mazEF系统在PCD中起作用。本实验通过基因组间上TA系统的比较分析,为进一步研究质粒在不同菌株（包括其它芽胞杆菌群菌株）的分布、进化等提供一定的遗传信息和理论依据,对多拷贝小质粒的稳定机制以及苏云金芽胞杆菌中隐蔽型质粒的功能提出了新的认识。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 细菌中的8个TA系统家族
• 1.1.1 F因子上的ccd系统
• 1.1.1.1 ccd系统的结构
• 1.1.1.2 ccd系统的毒素靶标和作用机制
• 1.1.1.3 CcdA与CcdB的比例能够调节TA系统操纵子的转录
• 1.1.2 大肠杆菌的relBE系统
• 1.1.2.1 RelE在核糖体A位点切割mRNA
• 1.1.2.2 relBE系统在细菌应急反应中起作用
• 1.1.3 Rts1质粒上的higBA系统
• 1.1.4 RK2质粒上的parDE系统
• 1.1.5 Pem（parD）和mazEF（chp）系统
• 1.1.5.1 MazE/MazF复合体的结构
• 1.1.5.2 MazF毒素蛋白的作用机制
• 1.1.5.3 能够触发mazEF的外界压力
• 1.1.5.4 TLD与mazEF系统有关
• 1.1.5.5 MazEF在细菌中广泛存在
• 1.1.5.6 MazEF与细菌的多细胞性
• 1.1.6 原噬菌体P1上的TA系统phd/doc
• 1.1.7 VapBC系统
• 1.1.8 质粒pSM19035上的ω-ε-ζ系统
• 1.1.9 其它的TA系统
• 1.1.9.1 限制修饰（RM）Ⅱ性系统
• 1.1.9.2 大肠杆菌K-12中的hipBA系统
• 1.2 TA系统结构的研究进展
• 1.2.1 TA系统的作用基础
• 1.2.2 TA系统在转录水平被抗毒素蛋白调节
• 1.2.3 毒素蛋白的进化关系
• 1.3 TA系统在自由生长的细菌中广泛分布
• 1.4 TA系统发挥功能的两个模型
• 1.4.1 简单的被动模型
• 1.4.2 主动控制模型
• 1.5 TA系统的生理学意义
• 1.5.1 TA系统与细菌利他致死机制相关
• 1.5.2 TA系统导致细菌进入生长停滞状态
• 1.5.3 染色体TA系统能够稳定基因转移因子
• 1.6 TA系统在构建新型载体上的应用
• 1.6.1 MazF基因作为反向选择基因
• 1.6.2 基于MazF基因作为反向选择基因的新型载体
• 1.7 TA系统总结
• 1.8 苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520简介
• 1.9 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂和仪器
• 2.1.3.1 试剂
• 2.1.3.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA操作
• 2.2.1.1 苏云金芽胞杆菌质粒的制备
• 2.2.1.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 2.2.1.3 质粒DNA的纯化
• 2.2.1.4 DNA的体外重组操作
• 2.2.2 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定
• 2.2.2.1 大肠杆菌的常规转化
• 2.2.2.2 苏云金芽胞杆菌的电转化
• 2.2.2.3 大肠杆菌转化子的筛选
• 2.2.2.4 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选
• 2.3 苏云金芽胞杆菌质粒稳定性检测
• 2.4 PCR扩增
• 2.5 斑点杂交
• 2.6 序列测定和序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 菌株YBT-1520质粒pBMB8240上TA系统的研究
• 3.1.1 质粒pBMB8240上TA系统的生物信息学分析
• 3.1.2 pBMB8240上毒素抗毒素基因的克隆
• 3.1.3 pBMB8240上潜在TA系统能够增强质粒稳定性
• 3.2 菌株YBT-1520中质粒pBMB7635上TA系统的研究
• 3.2.1 质粒pBMB7635上TA系统的生物信息学分析
• 3.2.2 pBMB7635上毒素抗毒素基因的克隆
• 3.2.3 pBMB7635上潜在的TA系统无法克隆
• 3.2.4 pBMB7635、pBMB9741和pGI1三个质粒序列一致性很高
• 3.3 YBT-1520中小质粒pBMB2062的研究
• 3.3.1 质粒pBMB2062上TA系统的生物信息学分析
• 3.3.2 YBT-1520质粒pBMB2062上ORF1的功能分析
• 3.3.2.1 质粒pBMB2062衍生质粒的构建
• 3.3.2.2 质粒pBMB2062衍生质粒的稳定性
• 3.3.3 质粒pBMB2062在苏云金芽胞杆菌中的分布调查
• 3.3.4 质粒pBMB2062与两个相近质粒的比较
• 3.4 库斯塔克亚种菌株YBT-1520染色体上TA系统的研究
• 3.4.1 芽胞杆菌染色体上的TA系统
• 3.4.2 TA系统在芽胞杆菌已测序质粒上分布的生物信息学分析
• 3.4.3 YBT-1520染色体上TA系统的生物信息学分析
• 3.4.3.1 YBT-1520染色体上其它TA系统的生物信息学分析
• 3.4.3.2 YBT-1520染色体上mazEF系统的生物信息学分析
• 3.4.4 YBT-1520染色体上MazEF系统的敲除实验
• 3.4.4.1 用PCR方法扩增mazEF及其上下游的序列
• 3.4.4.2 分别扩增A、B双臂构建出双交换载体
• 4 讨论
• 5 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录文章发表情况