2型糖尿病肾病尿液蛋白组学研究及早期诊断标志物的筛选

论文摘要

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy,DN）是2型糖尿病患者（Type 2diabetes mellitus,T2DM）最常见、最严重的慢性并发症,发病率逐年升高,已成为危害人类健康的重大疾病。在欧美国家DN也是终未期肾病（End-stage renaldisease,ESRD）的最常见病因,约占全部ESRD病例的44%。早期诊断DN并延缓其发展越来越受到人们的重视,但DN起病隐袭,目前临床上早期诊断DN存在较大困难。肾穿刺活检术创伤大,并发症多,而且费用较高,患者难以接受,不能作为T2DM患者检查的常规项目,而尿液富含肾脏病变信息,取材简单、无创伤,可重复取样,所以在DN早期诊断方面,对尿液的分析一直备受关注。目前临床上普遍采用尿微量白蛋白（Microalbuminuria,MALB）作为DN早期诊断指标,但已有许多研究发现MALB诊断DN的准确性和特异性不高,它受多种因素的影响,比如泌尿系统的炎症、出血,都会有血浆白蛋白的渗出或漏出,使尿白蛋白排出量增加,且在MALB出现时,DN已发展到第Ⅲ期,因而只依靠监测MALB并不能及时准确地对DN做出诊断,会带来较高的误诊和漏诊。随着蛋白质组学技术的发展,将其与体液技术相结合的尿液蛋白质组学技术为DN早期诊断标志物的筛选提供了技术支持,利用尿液蛋白质组学技术可能发现一些新的DN早期诊断标志物。本研究通过普通双向凝胶电泳（Two dimensionalgel electrophoresis,2-DE）和荧光差异双向凝胶电泳（Two dimensionalfluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE）技术对T2DM合并微量蛋白尿、大量蛋白尿、正常蛋白尿的患者,以及健康志愿者的尿液标本进行比较蛋白组学分析,筛选DN患者尿液中的差异表达蛋白,对差异蛋白进行质谱鉴定和生物信息学分析,并挑选出两种感兴趣的差异蛋白进行深入研究,评价其与2型糖尿病肾病的关系以及早期诊断糖尿病肾病的价值,本课题研究内容共分为以下五部分。第一部分2型糖尿病肾病患者尿液2-DE图谱的建立及差异蛋白的筛选目的建立T2DM合并正常蛋白尿组（无肾病期）、微量蛋白尿组（DN早期）、大量蛋白尿组（DN临床期）以及正常对照组的尿液双向凝胶电泳（2-DE）图谱及相关技术,并分析比较四组尿液2-DE图谱的差异,筛选出在2型糖尿病肾病患者差异表达的蛋白点。方法收集8例T2DM合并大量蛋白尿患者（UAER＞300mg/24h,DN2组）,8例T2DM合并微量蛋白尿患者（30＜UAER＜300mg/24h,DN1组）,8例T2DM合并正常蛋白尿患者（UAER＜30mg/24h,DM组）,以及8例年龄、性别相匹配的健康志愿者（control组）的晨起清洁中段尿。所有尿液样本经透析除盐后采用冷丙酮沉淀法获取尿蛋白,以固相IPG pH梯度等电聚焦为第一向,SDS均一胶的垂直电泳为第二向,银染后用PDQuest软件配比分析,筛选差异表达蛋白点。结果成功获得不同时期2型糖尿病。肾病患者的尿液蛋白2-DE图谱。PDQuest软件对四组图像进行统计分析,发现DN2组凝胶的平均蛋白质点数为217±42,DN1组凝胶的平均蛋白质点数为178±36,DM组凝胶的平均蛋白质点数为135±31,control组凝胶的平均蛋白质点数为98±27（（?）±s）,经四组图像的定量、对比分析,在DN组寻找到16个差异蛋白点（ratio＞2.0,p＜0.01）,其中9个在DN组出现上调,7个出现下调。结论对不同时期2型糖尿病肾病患者的尿液进行2-DE分析是可行的,可以获得清晰的DN患者尿液2-DE图谱,并筛选到多个差异蛋白点。第二部分2型糖尿病肾病患者尿液2D-DIGE图谱的建立及差异蛋白的筛选目的为了弥补2-DE技术重复性较差的缺陷,提高本研究的准确度、可信度。本实验同时采用了荧光差异双向凝胶电泳（2D-DIGE）技术对2型糖尿病合并正常蛋白尿组、微量蛋白尿组、大量蛋白尿组以及健康对照组的尿液样本进行分析,构建不同时期DN患者尿液的2D-DIGE图谱,并通过软件比较分析,筛选出在2型DN患者尿液中差异表达的蛋白点。方法收集T2DM合并正常蛋白尿（DM）、微量蛋白尿（DN1）、大量蛋白尿（DN2）以及健康对照组（Control）的尿液标本各8例（同第一部分）,将各组尿样等量混合成四份样本。经透析除盐后采用冷丙酮沉淀法获取尿液总蛋白,对制备好的四份尿蛋白样本用荧光材料Cy3或Cy5分别进行标记,同时设立内标用Cy2标记。然后以固相IPG pH梯度等电聚焦为第一向,SDS均一胶的垂直电泳为第二向进行双向凝胶电泳,荧光扫描仪扫描凝胶,利用DeCyder软件对图像进行配比分析,筛选差异表达蛋白点。结果成功获得不同时期2型糖尿病肾病患者的尿液2D-DIGE图谱。分别用不同波长激光对Cy2（488 nm）、Cy3（532nm）、Cy5（633nm）进行扫描,得到不同颜色的扫描图,经DeCyder软件对荧光图像进行分析,每张胶图得到大于400个蛋白质点。与内标配比分析后,共得到21个差异表达蛋白点（ratio＞2.0,p＜0.01）,其中13个在DN组上调,8个下调。结论对不同时期2型DN患者的混合尿液样本进行2D-DIGE的蛋白组学分析是准确可行的,与传统2-DE技术相比,不仅省时、省力,而且可以筛选到更多的差异蛋白点。第三部分差异蛋白的质谱鉴定及生物信息学分析目的对2-DE技术寻找到的的16个差异蛋白点,以及2D-DIGE技术寻找到的21个差异蛋白点行质谱鉴定,并对鉴定出的蛋白进行生物信息学初步分析。方法首先将37个差异蛋白点自凝胶中切下后行胰酶酶解,在反射模式下进行基质辅助激光吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析,获得肽质量指纹图（PMF）。通过MASCOT软件进行肽段的鉴定,并将鉴定出的蛋白质输入Swiss-Prot或者TrEMBL数据库可以得到相关蛋白的基本生物信息学数据。结果2-DE技术寻找到的16个差异蛋白点经质谱鉴定和数据分析,得到8种蛋白质,其中在DN组上调的蛋白质6个,分别是:上皮细胞钙粘蛋白（Epithelial-cadherin,E-cadherin）,血清白蛋白（Serum albumin）,锌-a2糖蛋白（Zinc-alpha-2-glycoprotein）,a1-酸性糖蛋白（Orosomucoid）,视黄醇结合蛋白（retinol-binding protein）,激肽原（Kininogen）。在DN组下调的蛋白质2个,分别是:尿调节素（Uromodulin）,转甲状腺素蛋白（Transthyretin）。2D-DIGE技术寻找到的21个差异蛋白点经质谱鉴定和数据分析,得到10个蛋白质,其中在DN组上调的蛋白质7个,分别是上皮细胞钙粘蛋白（Epithelial-cadherin,E-cadherin）,血清白蛋白（Serum albumin）,锌-a2糖蛋白（Zinc-alpha-2-glycoprotein）,a1-酸性糖蛋白（Orosomucoid）,视黄醇结合蛋白（Retinol-binding protein）,前列腺素-H2D-异构酶（Prostaglandin-H2D-isomerase）,免疫球蛋白κ链C区（Ig kappa chain Cregion）;在DN组下调的蛋白质3个,分别是:AMBP蛋白（AMBP protein）,尿调节素（Uromodulin）,触珠蛋白（Haptoglobin）。在所有被鉴定出的蛋白中,有6种蛋白通过2-DE/MS和2D-DIGE/MS两种蛋白组学方法均被鉴定出来,分别是:上皮细胞钙粘蛋白,血清白蛋白,锌-a2糖蛋白,a1-酸性糖蛋白,视黄醇结合蛋白,尿调节素。结论通过MALDI-TOF-MS质谱鉴定和生物信息学分析,可以准确的鉴定出在DN患者尿液中差异表达的蛋白质。这些差异蛋白的识别为DN早期诊断的研究提供了候选标志物,有助于DN早期诊断和发病机制的深入探索。第四部分差异蛋白E-cadherin与2型糖尿病肾病的相关性研究目的验证差异蛋白“上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）”在T2DM合并微量蛋白尿、大量蛋白尿,正常蛋白尿患者,以及健康对照者尿液中的表达及浓度变化,分析其诊断DN的价值。检测E-cadherin在DN患者和正常人肾脏组织中的表达,了解其在DN发病机制中的作用。方法用Western blot方法对24例T2DM合并微量蛋白尿（DN1）、大量蛋白尿（DN2）,正常蛋白尿（DM）,以及健康对照者（control）的尿液标本（各6例）进行分析,验证E-cadherin在尿液中的表达;另外收集160例T2DM合并微量蛋白尿、大量蛋白尿、正常蛋白尿,以及健康对照者的尿液标本（各40例）,用ELISA方法检测尿液中E-cadherin的含量,分析E-cadherin在不同时期2型糖尿病肾病患者尿液中的变化情况,并初步计算尿E-cadherin诊断DN的准确性和特异性;收集5例诊断为DN的T2DM患者的肾活检标本,同时收集4例正常人的肾脏组织标本（肾移植供体肾的活检标本）作为对照。用免疫组化的方法检测E-cadherin在DN患者肾组织中的表达变化。结果Western blot结果显示,在正常对照组的尿液中未检测到E-cadherin的表达,在DM、DN1、DN2组的尿液标本中均检测到了可溶性80KD片段的E-cadherin的表达（sE-cadherin）,同时发现sE-cadherin在DN2组尿液标本中大量表达,在DN1组尿液标本中中量表达,在DM组尿液标本仅有微量表达。ELISA数据也显示了sE-cadherin在尿液中的水平随着DN的进展而逐渐升高。与DM或control组相比,尿sE-cadherin/Cr的水平在DN1、DN2组均显著升高（2751.5±164,5839.6±428 vs.721.9±93 or 652.7±87ug/g;p＜0.001）,而且DN2组显著高于DN1组（5839.6±428 vs.2751.5±164ug/g;p＜0.01）。与control组相比,尿sE-cadherin/Cr在DM组的变化无统计学意义（721.9±93vs.652.7±87ug/g;p＞0.05）。经计算,尿sE-cadherin/Cr诊断DN的敏感性和特异性分别是:78.8%（95%CI,74-83%）和80%（95%CI,65-91%）。同时,Pearson相关分析和逐步回归分析也显示:尿sE-cadherin/Cr与尿白蛋白排泄率,以及血清肌酐呈显著正相关（r=0.861,r=0.713;p＜0.01）,血清肌酐是尿sE-cadherin/Cr的独立影响因子（R2=0.831,F=56.72;p＜0.01）。另外,我们的免疫组化的结果显示E-cadherin主要表达于肾小管上皮细胞的细胞膜和细胞浆,它在DN肾脏中的表达较正常肾脏显著降低。结论尿sE-cadherin具有潜在的早期诊断DN的价值,它在2型DN患者尿液中的浓度显著升高,而且随着肾病的进展逐渐增加。另外,E-cadherin在DN患者肾脏中的表达显著减少,它可能参与DN的发生与发展。第五部分差异蛋白orosomucoid与2型糖尿病肾病的相关性研究目的分析差异蛋白“a1-酸性糖蛋白（orosomucoid）”在T2DM合并微量蛋白尿、大量蛋白尿、正常蛋白尿患者,以及健康人尿液中的浓度变化,评价尿orosomucoid的排泄率（UOER）与DN的关系,以及诊断DN的价值。方法定时收集160例T2DM合并微量蛋白尿（DN1）、大量蛋白尿（DN2）、正常蛋白尿患者（DM）,以及健康对照者的尿液标本（各40例,同第四部分）。用免疫比浊法检测所有尿液样本中orosomucoid的含量,计算其在尿液中的排泄率UOER,评价UOER在不同时期2型DN患者尿液中的变化。用Pearson相关分析和多元Logistic回归分析来评价UOER与DN的相关性,并计算UOER诊断DN的敏感性和特异性。结果免疫比浊法的检测结果显示,与control组相比,UOER在DM、DN1、DN2组是增加的,而且逐渐升高（0.91±0.37,1.87±0.72,2.95±0.84 vs.0.42±0.19 ug/min;P＜0.05）。Pearson相关分析显示UOER和UAER、血清肌酐、C-反应蛋白密切相关（r=0.781,0.695,0.401,respectively;P＜0.05）。而且,多元Logistic回归分析显示升高的UOER是DN的独立危险因素（OR=2.88,P＜0.01）。另外,通过初步计算,UOER诊断DN的敏感性和特异性分别是:75.8%（95%CI,71-82%）和69%（95%CI,58-83%）。结论UOER具有潜在的早期诊断DN的价值,它在DN发病早期就出现升高,并随着肾病的进展逐步升高。另外,升高的UOER也是DN的独立危险因素。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 引言
• 第一部分 2型糖尿病肾病患者尿液2-DE图谱的建立及差异蛋白的筛选
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附图与附表
• 第二部分 2型糖尿病肾病患者尿液2D-DIGE图谱的建立及差异蛋白的筛选
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图与附表
• 第三部分 差异蛋白的质谱鉴定及生物信息学分析
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图和附表
• 第四部分 差异蛋白E-cadherin与2型糖尿病肾病的相关性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图与附表
• 第五部分 差异蛋白orosomucoid与2型糖尿病肾病的相关性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图与附表
• 全文小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 附:发表的外文论文一
• 附:发表的外文论文二
• 学位论文评阅及答辩情况表