牦牛、黄牛及其异种体外受精和早期胚胎发育的比较研究

论文摘要

利用普通牛对牦牛开展种间杂交改良,可以有效提高牦牛生产性能,杂种一代（F1）表现出很强的杂种优势,但是这种种间杂交受胎率低下。本研究在屠宰牦牛和黄牛的卵巢上收集卵丘-卵母细胞复合体（COCs）,分别采用牦牛和黄牛的精子进行纯种、异种体外受精（IVF）,从纯种受精（黄牛纯繁、牦牛纯繁）和异种受精（黄牛♀×牦牛♂、牦牛♀×黄牛♂）四个受精组合的受精率、卵裂率和囊胚率方面探索纯种和异种受精机制,探讨异种受胎率低在精-卵受精和早期胚胎发育的原因,并为胚胎的后续研究和体外生产奠定基础。（1）四个受精组合在受精水平的比较研究。在屠宰场采集牦牛和黄牛卵巢,抽取卵泡获得COCs,将COCs在以TCM-199液为基础液中成熟培养,培养液中添加有100μg/ml谷氨酰胺,20%胎牛血清,5μg/ml FSH,5μg/ml LH,1μg/ml雌二醇,成熟培养24h。成熟后的卵母细胞分别与体外获能处理后的黄牛精子和牦牛精子在添加有6mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的人工合成输卵管液（SOF）中培养受精。精-卵共培养18h后对卵母细胞（n=339）进行醋酸地衣红染色,镜检。根据卵母细胞中原核（PN）的数量判定受精情况,0PN为未受精卵、1PN为受精后发育异常卵、2PN为正常受精卵、>2PN为多精受精卵。结果表明:黄牛纯繁、黄牛♀×牦牛♂、牦牛纯繁和牦牛♀×黄牛♂的总受精率分别为84.3%、90.5%、82.3%和78.5%,黄牛♀×牦牛♂和牦牛♀×黄牛♂异种之间存在显著性差异（P<0.05）;正常受精率分别为71.1%、76.2%、65.8%和68.8%;多精受精率分别为12.0%、14.3%、15.2%和8.6%。以黄牛COCs受精的组合总受精率和正常受精率都高于牦牛COCs的受精组合,牦牛精子受精的组合多精受精率高于黄牛精子受精的组合（P>0.05）。（2）四个受精组合IVF后48h的卵裂率的比较研究。受精24h的胚胎（n=1649）,转入早期胚胎培养液（IVC）,IVC为在SOF中加入6mg/ml BSA,50μg/ml肌醇,3%（v:v）必需氨基酸,1%（v:v）非必需氨基酸,30μg/ml谷胺酰胺。在IVF后48h观察每个组合卵裂情况,并比较2-cell、4-cell、8-cell的比率。结果表明:以黄牛COCs受精的组合的卵裂率（黄牛纯繁为67.0%、黄牛♀×牦牛♂为72.4%）高于以牦牛COCs受精的组合（牦牛纯繁为65.0%、牦牛♀×黄牛♂为61.1%）,在黄牛♀×牦牛♂异种和牦牛♀×黄牛♂异种之间存在显著性差异（P<0.05）;以黄牛COCs受精的组合胚胎发育速度更快,有更多的细胞处于8-cell。（3）四个受精组合囊胚发育率的比较研究。IVF后96h更换一次胚胎培养液,在IVF后第7、8、9和10天分别收集囊胚,统计总囊胚率,并比较囊胚发育速度。结果表明:黄牛纯繁、黄牛♀×牦牛♂、牦牛纯繁和牦牛♀×黄牛♂异种的总囊胚率分别为:29.4%、37.9%、11.4%和16.3%;黄牛纯繁和黄牛♀×牦牛♂收获的囊胚主要在第7、8天（分别为68.1%和80.7%）,牦牛纯繁和牦牛♀×黄牛♂收获的囊胚主要集中在第8、9天（分别为59.6%和79.8%）。以黄牛卵母细胞受精的组合囊胚率高于以牦牛卵母细胞受精的组合,并且囊胚发育速度更快。研究结果证明,牦牛和普通牛之间能完成正常的受精,但是,牦牛和普通牛及其杂种胚胎在早期胚胎发育能力上的确存在一定差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 牦牛繁殖研究现状
• 1 牦牛繁殖性能特征
• 2 种间杂交及犏牛雄性不育
• 3 牦牛诱导发情和同期发情
• 第二章 哺乳动物体外受精研究进展
• 1 体外受精技术及其发展历程
• 2 体外受精技术程序
• 2.1 卵母细胞体外成熟
• 2.1.1 卵母细胞的来源
• 2.1.2 体外成熟培养系统
• 2.2 精子体外获能
• 2.3 体外受精
• 2.3.1 精卵识别
• 2.3.2 卵的激活
• 2.3.3 原核的形成与融合
• 2.3.4 体外受精影响因素
• 2.3.5 多精受精
• 2.4 早期胚胎发育
• 2.4.1 发育阻滞
• 2.4.2 早期胚胎培养系统
• 2.4.3 更换培养液
• 2.5 牦牛的体外受精研究现状
• 第二部分 试验研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 试剂与耗材
• 1.1.4 试剂配置
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 早期胚胎发育
• 1.2.2 精子穿卵率分析
• 1.3 试验设计
• 1.3.1 不同受精组合的穿卵率比较
• 1.3.2 不同受精组合的卵裂率比较
• 1.3.3 不同受精组合的囊胚发育率比较
• 1.4 统计分析
• 2 结果和分析
• 2.1 不同受精组合的穿卵率
• 2.2 不同受精组合的卵裂率
• 2.3 不同受精组合囊胚发育率
• 3 讨论
• 3.1 不同受精组合穿卵率差异
• 3.2 不同受精组合的早期胚胎发育能力
• 3.2.1 早期胚胎发育速度
• 3.2.2 卵裂率和囊胚率
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文