滑膜成纤维细胞中促炎因子IL-6、VEGF影响骨关节炎病情进展的实验研究

论文摘要

第一部分IL-6、VEGF在膝骨关节炎患者关节滑膜和滑液中的表达及其意义目的:检测不同阶段的膝骨关节炎（osteoarthritis,OA）患者关节滑膜组织和滑液中白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达情况,明确滑膜组织在OA发生发展过程中的作用,评价VEGF作为进展期OA标志的可行性。方法:临床收集膝关节镜或关节置换手术患者的关节滑液和滑膜组织,根据X线平片的K-L分级进行分组。以K-L分级均为0级的单纯膝关节半月板损伤的患者作为对照组。酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测各组关节液中IL-6、VEGF的含量,免疫组织化学染色方法检测IL-6、VEGF在滑膜组织中的原位表达。结果:K-LⅡ、Ⅲ级的关节滑液中IL-6水平显著增高,差异有统计学意义;而K-LⅣ级患者关节滑液中IL-6水平下降接近对照组。各实验组的滑液中VEGF水平逐级增高,明显高于对照组。OA滑膜组织普遍存在不同程度的炎症,滑膜色泽变暗红,组织增生,甚至呈绒毛样增生改变。免疫组织化学染色显示,IL-6在滑膜衬里层及衬里下层细胞表达;VEGF在在滑膜衬里层及血管平滑肌细胞表达。结论:关节滑膜参与了骨关节炎的病理过程,滑膜产生的IL-6、VEGF很可能就是导致滑膜自身炎症慢性化、持续化的主要因素。滑液中VEGF水平的持续升高可作为判断OA病情活动的一个指标。第二部分IL-6对体外培养的滑膜成纤维样细胞生物学行为的影响目的:观察IL-6对体外培养的滑膜成纤维样细胞（fibroblastlike synoviocyte,FLS）生物学行为的影响,探讨滑膜组织参与关节软骨破坏的作用机制。方法:首先对关节置换手术切除的OA滑膜组织作原代细胞培养,通过流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD14、CD90抗原的表达情况对细胞进行鉴定。对3-5代的FLS分别予以不同浓度的IL-6、IL-1以及IL-6+IL-1刺激,ELISA法检测细胞上清液中VEGF、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinases,MMP-13）的含量,逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测IL-6诱导的FLS中VEGF、MMP-13的mRNA表达。结果:流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD14、CD90表达,结果:CD90+为95.62%,CD3+为2.64%,CD14+为3.44%,符合成纤维样细胞的特征。ELISA和RT-PCR检测结果表明,单独应用IL-6刺激FLS,上清液中VEGF的含量有所增加,而MMP-13的水平则无明显变化;单独应用IL-1刺激FLS,上清液中VEGF、MMP-13的含量明显升高;二者联合使用,VEGF、MMP-13的含量升高最显著。结论:IL-6本身诱导FLS合成与分泌VEGF、MMP-13的能力并不强,但是能协同IL-1放大OA-FLS的分泌功能。IL-6促使IL-1诱导的FLS合成与分泌MMP-13增加,从一个方面揭示了滑膜组织参与关节软骨降解的途径;IL-6促使IL-1诱导的FLS合成与分泌VEGF增加,则说明了滑膜组织的炎症反应能够持续性存在的部分原因。第三部分p38MAPK抑制剂对滑膜成纤维样细胞表达VEGF、MMP-13的影响及应用前景分析目的:研究IL-6参与OA关节病变的信号传导通路,探讨p38MAPK选择性抑制剂应用于OA治疗的可能性。方法:1.对IL-6+IL-1诱导的3-5代的FLS分别予以不同浓度的p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen actived proteinkinase,p38MAPK）选择性抑制剂SB220025进行干预,RT-PCR、Western-blot检测VEGF、MMP-13的表达。2.分别用SB220025、地塞米松、美洛昔康对IL-1、IL-6诱导的FLS进行干预,RT-PCR、Western-blot检测VEGF、MMP-13的表达。结果:0.25ug/ml的SB220025就已充分显示出其对VEGF、MMP-13的表达的强烈抑制,而且随着剂量的增加效果更明显。SB-220025对VEGF的表达的抑制效果强于美洛昔康、地塞米松;对MMP-13表达的抑制效果远远强于美洛昔康、地塞米松。结论:IL-6、IL-1诱导的FLS中VEGF、MMP-13的表达需要p38MAPK通路的激活,SB-220025可以剂量依赖方式阻断这一效应。体外试验支持p38MAPK选择性抑制剂可以应用于OA治疗,效果强于美洛昔康、地塞米松。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 IL-6、VEGF在膝骨关节炎患者关节滑膜和滑液中的表达及其意义
• 1.材料和方法
• 1.1 研究对象
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 标本的收集和处理
• 1.5 双抗体夹心ABC——ELISA法检测关节液中IL-6及VEGF水平
• 1.6 滑膜组织切片病理学研究
• 1.7 统计学方法
• 2.结果
• 2.1 关节滑液ELISA法检测结果
• 2.2 滑膜组织切片染色结果
• 3.讨论
• 3.1 IL-6与OA
• 3.2 血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）与OA
• 结论
• 第二部分 IL-6对体外培养的滑膜成纤维样细胞生物学行为的影响
• 1.材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 滑膜成纤维样细胞培养
• 1.4 人关节滑膜成纤维样细胞（FLS）的鉴定
• 1.5 细胞干预方案
• 1.6 细胞总RNA提取和定量
• 1.7 RT-PCR检测IL-6诱导的FLS中VEGF、MMP-13的mRNA表达
• 1.8 ELISA法检测上清液中VEGF、MMP-13的含量
• 1.9 统计学分析
• 2.结果
• 2.1 滑膜成纤维样细胞的鉴定
• 2.2 RT-PCR检测IL-6诱导的FLS中VEGF、MMP-13的mRNA表达
• 2.3 ELISA法检测IL-6诱导的FLS上清液中VEGF、MMP-13的含量
• 3.讨论
• 3.1 人关节滑膜成纤维样细胞的培养
• 3.2 VEGF、MMP-13在白细胞介素-6（IL-6）诱导的滑膜成纤维样细胞（FLS）中表达的意义
• 结论
• 第三部分 p38MAPK抑制剂对滑膜成纤维样细胞表达VEGF、MMP-13的影响及应用前景分析
• 1.材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 滑膜成纤维样细胞干预方案
• 1.4 细胞蛋白提取和定量
• 1.5 Western-blot分析IL-6、IL-1诱导的FLS中VEGF、MMP-13的蛋白表达
• 1.6 RT-PCR检测IL-6、IL-1诱导的FLS中VEGF、MMP-13的mRNA表达
• 2.结果
• 2.1 p38MAPK选择性抑制剂SB220025处理的FLS形态学的变化
• 2.2 不同浓度的SB220025对IL-1和IL-6诱导的FLS合成VEGF、MMP-13的影响
• 2.3 SB220025、地塞米松、美洛昔康对IL-1、IL-6诱导的FLS中VEGF、MMP-13表达的作用对比
• 3.讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述（一）
• 综述（二）
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文