GAPDH过表达及异常聚集在帕金森病发病机制中作用的研究

论文摘要

第一部分鱼藤酮对GAPDH的表达、定位及聚集的影响第一节鱼藤酮对GAPDH的表达、亚细胞定位及糖酵解活性的影响目的研究鱼藤酮对PC12细胞内糖酵解关键酶GAPDH的表达、亚细胞定位及糖酵解活性的影响。方法鱼藤酮作用于体外培养的神经生长因子诱导分化的PC12细胞，采用FITC-Annexin V／PI染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡水平；通过实时荧光定量PCR（real-time PCR）和蛋白免疫印迹分析（Western blot）检测鱼藤酮对PC12细胞内GAPDH mRNA和蛋白表达水平的影响；使用亚细胞组分分离及Western blot观察GAPDH的亚细胞定位改变；根据比尔定律采用分光光度法测定鱼藤酮处理后细胞内GAPDH糖酵解活性的改变。结果流式细胞仪检测结果显示，鱼藤酮可时间依赖性的诱发PC12细胞凋亡。实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹分析显示，鱼藤酮处理后细胞内GAPDH mRNA和蛋白表达水平均随时间的延长呈升高趋势；而随处理时间的延长，GAPDH的糖酵解酶活性反而下降；亚细胞组分分离及Western blot进一步证实，鱼藤酮处理后GAPDH主要在细胞核及线粒体组分内增多。结论鱼藤酮可以诱发GAPDH的过表达、抑制GAPDH糖酵解活性并导致GAPDH亚细胞定位的改变，这可能是鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元凋亡的重要机制之一。第二节鱼藤酮导致GAPDH的聚集及可能的原因目的探讨鱼藤酮对GAPDH聚集的影响及可能的原因。方法鱼藤酮作用于体外培养的神经生长因子诱导分化的PC12细胞，使用激光共聚焦荧光显微镜观察细胞中GAPDH的分布和性状改变；用非还原型SDS-PAGE检测细胞内GAPDH二硫化物多聚体的变化；分别提取胞浆内去垢剂可溶及去垢剂不溶的蛋白，使用Western blot检测细胞内GAPDH可溶状态的改变。结果激光共聚焦结果显示，正常细胞内GAPDH蛋白均匀分布于胞浆，在细胞核内仅有少量分布。鱼藤酮处理后，胞浆内GAPDH染色增强，且出现明显的GAPDH染色阳性的聚集颗粒，部分细胞胞核内也出现GAPDH的团块状聚集。非还原型SDS-PAGE显示鱼藤酮处理可时间依赖性的增加细胞内二硫化键连接的GAPDH。随鱼藤酮处理时间的延长，细胞内的GAPDH去垢剂可溶及去垢剂不溶的GAPDH均增多，提示细胞内GAPDH可能出现了可溶性质的改变并进一步产生聚集。结论鱼藤酮可以导致细胞内GAPDH的颗粒状聚集。其聚集的可能原因是分子间二硫键的相互连接形成多聚体，并进一步聚集形成去垢剂难溶的蛋白。这可能是鱼藤酮诱导的神经元凋亡及包涵体形成的重要机制。第二部分干扰GAPDH的过表达对多巴胺能神经元的影响及作用机制目的研究RNA干扰（RNAi）技术能否有效抑制GAPDH的表达以及对鱼藤酮诱导的细胞凋亡的影响及机制。方法在实验过程中均添加1mM的丙酮酸以代偿干扰引起的GAPDH糖酵解酶活性的改变。使用脂质体lipofectamine2000将体外化学合成的针对GAPDH基因的小干扰RNA（siRNA）转染进入细胞，使用FAM标记的siRNA进行转染效率的检测，通过实时荧光定量PCR（real-time PCR）和蛋白免疫印迹分析（Western blot）进行干扰效果的鉴定；使用激光共聚焦荧光显微镜观察干扰对鱼藤酮诱导的GAPDH定位和性状的影响；罗丹明123染色流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化，Annexin V及PI双染检测细胞凋亡比率。结果实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹分析显示，化学合成的siRNA可有效抑制细胞内GAPDH mRNA和蛋白水平的表达；激光共聚焦荧光显微镜结果显示，干扰GAPDH的表达可减少鱼藤酮所致的GAPDH的聚集及核转位；流式细胞仪检测发现干扰GAPDH表达可明显减少细胞线粒体膜电位的下降和细胞凋亡。结论RNA干扰可减少鱼藤酮诱发的GAPDH的过度表达，减少鱼藤酮诱发的GAPDH的颗粒状聚集及线粒体膜电位的下降和细胞凋亡。第三部分鱼藤酮帕金森病大鼠模型的建立及GAPDH的表达和活性改变第一节鱼藤酮慢性皮下注射及立体定向注射帕金森病大鼠模型的建立及评价目的通过鱼藤酮慢性皮下注射及鱼藤酮立体定向注射建立帕金森病大鼠模型，并进行行为学及组织学鉴定。方法采用背部皮下注射鱼藤酮及立体定向注射鱼藤酮的方法建立帕金森病大鼠模型，使用bar test、grid test、阿扑吗啡诱导的旋转行为观察大鼠的行为学改变；使用HE染色、α-synuclein、泛素（ubiquitin，UB）等抗体染色观察鱼藤酮的外周毒性及细胞内包涵体的形成情况，使用酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体检测大鼠中脑黑质多巴胺能神经元的表达变化。结果鱼藤酮背部皮下注射及立体定向注射均可诱导大鼠出现行动迟缓、自主活动减少等行为学改变，bar test、grid test均显示鱼藤酮处理的大鼠运动潜伏期较对照组明显延长。阿扑吗啡也可诱导立体定向鱼藤酮注射的大鼠出现明显的旋转行为。免疫组化结果显示，两种模型均能导致大鼠中脑黑质内酪氨酸羟化酶免疫活性的下降，并出现α-synuclein和泛素染色阳性的嗜酸性包涵体。此外，在鱼藤酮背部皮下注射的大鼠还观察到明显的外周器官毒性，如肝脏炎症细胞浸润、肾脏局部缺血坏死等，而立体定向注射组未观察到明显的外周毒性。结论鱼藤酮背部皮下注射及立体定向注射均可成功的制作帕金森病大鼠模型。第二节鱼藤酮帕金森病大鼠模型中GAPDH的表达及活性改变目的探讨鱼藤酮帕金森病大鼠模型中GAPDH的表达、酶活性及定位的改变。方法采用鱼藤酮背部皮下注射及立体定向注射的方法，建立鱼藤酮帕金森病大鼠模型。使用免疫组织化学方法观察大鼠皮质、海马、黑质、纹状体等部位GAPDH的表达和定位变化；分光光度计测量各组模型中各脑区内GAPDH糖酵解酶活性的改变。结果在鱼藤酮处理的大鼠中，黑质区神经元胞浆内出现GAPDH表达增高，尤以鱼藤酮立体定向注射的大鼠更为明显。在立体定向注射的大鼠中，还出现GAPDH在胞核内的聚集。而慢性鱼藤酮注射不仅抑制大鼠黑质、纹状体、皮质等部位的GAPDH糖酵解活性，对外周脏器如肝脏、肾脏的GAPDH糖酵解活性也有明显抑制作用。鱼藤酮立体定向模型中则仅发现有黑质及纹状体部位GAPDH糖酵解活性的抑制，外周器官GAPDH酶活性不受影响。结论鱼藤酮可以诱导大鼠中脑黑质GAPDH的过表达，并抑制GAPDH糖酵解活性，这可能是鱼藤酮导致的中脑黑质多巴胺能神经元变性的原因之一。第四部分司来吉兰对鱼藤酮诱导的帕金森病模型的保护作用及机制第一节司来吉兰对鱼藤酮处理的PC12细胞的保护作用及机制目的研究司来吉兰对鱼藤酮处理的PC12细胞的保护作用及机制。方法采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞活力，选定药物干预浓度；通过荧光定量PCR（real-time PCR）和蛋白免疫印迹技术（Westem blot）检测司来吉兰处理对鱼藤酮诱导的GAPDH mRNA和蛋白过表达的影响；根据比尔定律采用分光光度法测定细胞内GAPDH糖酵解活性的改变；激光共聚焦荧光显微镜、亚细胞组分分离及Westem blot观察GAPDH的亚细胞定位和性状改变，流式细胞仪检测线粒体膜电位和细胞凋亡。结果MTT结果显示，10nM～250μM浓度范围内的司来吉兰具有细胞保护作用。实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹分析显示，司来吉兰可减少鱼藤酮诱导的GAPDHmRNA和蛋白的过表达，减少GAPDH糖酵解酶活性的下降；激光共聚焦荧光显微镜显示，司来吉兰可减少GAPDH在胞浆内的聚集及细胞核转位；亚细胞组分分离及Western blot进一步证明，司来吉兰可减少GAPDH在细胞核及线粒体组分内的富集。流式细胞仪检测发现司来吉兰可减少细胞线粒体膜电位的下降和细胞凋亡。结论司来吉兰可抑制GAPDH的过表达、减少GAPDH糖酵解活性的下降，减少GAPDH在细胞核和线粒体内的聚集及线粒体膜电位的下降，这可能是司来吉兰发挥神经保护作用的重要机制。第二节司来吉兰对鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠模型的保护作用及机制目的探讨司来吉兰对鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠模型的保护作用及机制方法动物随机分为葵花油皮下注射组、鱼藤酮皮下注射组、鱼藤酮皮下+司来吉兰注射组；DMSO立体定向组、鱼藤酮立体定向组、鱼藤酮立体定向+司来吉兰注射组。使用bar test、grid test、阿扑吗啡诱导的旋转行为观察各组大鼠的行为学改变；使用HE染色观察外周毒性，使用免疫组织化学方法观察大鼠皮质、海马、黑质、纹状体等部位GAPDH的表达和定位改变，分光光度计测量各组模型中各脑区GAPDH糖酵解酶活性的变化。结果鱼藤酮皮下注射及立体定向注射均可导致大鼠出现行动迟缓，动作潜伏期延长等帕金森病症候群。免疫组化染色显示，鱼藤酮可以导致大鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶活性的下降及GAPDH的过表达。而司来吉兰处理可改善大鼠的行动迟缓、动作潜伏期延长等行为学症状，减少大鼠黑质神经元胞浆内GAPDH阳性物质浓染聚集及胞核内GAPDH的聚集，也可部分缓解大鼠黑质、纹状体等部位的GAPDH糖酵解活性的下降。在皮下注射组，司来吉兰还可以减缓鱼藤酮导致的动物外周器官如肝脏、肾脏内GAPDH糖酵解活性的下降。结论司来吉兰可以通过减少GAPDH的过表达，减少GAPDH糖酵解活性的损伤发挥神经保护作用。

论文目录

• 研究背景
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 鱼藤酮对GAPDH的表达、定位及聚集的影响
• 第一节 鱼藤酮对GAPDH的表达、亚细胞定位及糖酵解活性的影响
• 第二节 鱼藤酮导致GAPDH的聚集及可能的原因
• 参考文献
• 第二部分 干扰GAPDH的过表达对多巴胺能神经元的影响及作用机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 鱼藤酮PD大鼠模型的建立及GAPDH的表达和活性改变
• 第一节 鱼藤酮慢性皮下注射及立体定向注射PD大鼠模型的建立及评价
• 第二节 鱼藤酮PD大鼠模型中GAPDH的表达及活性改变
• 参考文献
• 第四部分 司来吉兰对鱼藤酮诱导的PD模型的保护作用及机制
• 第一节 司来吉兰对鱼藤酮处理的PC12细胞的保护作用及机制
• 第二节 司来吉兰对鱼藤酮大鼠模型的保护作用及机制
• 参考文献
• 全文小结
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表论文及参与课题情况
• 英文缩略词表
• 致谢