DACH1在结直肠癌中的表观遗传学调控及其在TGF-β和Wnt信号通路中的作用

论文摘要

背景结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是西方国家癌症相关死亡第二大主因。随着饮食结构和生活习惯的改变，我国结直肠癌发病率不断上升。在结直肠癌的发生发展过程中，表观遗传学改变，尤其是抑癌基因启动子区高甲基化，越来越受到人们的重视。Wnt和TGF-β信号通路的异常被认为是结直肠癌的发生的重要机制。目前的研究表明，TGF-β和Wnt信号通路之间存在交互作用（crosstalk）。DACH1（dachshund homolog1）在多种肿瘤（乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌等）中表达降低，起着抑癌基因的作用，在乳腺癌和卵巢癌中被证实能够抑制TGF-β信号通路。但是DACH1的表达调控以及在结直肠癌中的作用和作用机制尚不清楚。目的本研究旨在研究DACH1在结直肠癌中的表观遗传学改变及对其表达的调控；本研究对DACH1在结直肠癌发生中的作用及作用机制也进行了探讨。结合分析病人的临床资料，阐明DACH1表观遗传改变和结直肠癌病人相关临床指标的关系，以期获得结直肠癌诊断和预后的表观遗传学标志物。通过研究DACH1在TGF-β及Wnt信号通路中的作用及其机制，为探讨结直肠癌的分子靶向治疗奠定基础。方法应用半定量RT-PCR方法在5株结直肠癌细胞系中检测甲基转移酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine （5-aza-dc）处理前后DACH1在mRNA的表达水平；应用甲基化特异性PCR检测5株结直肠癌细胞系（HCT116，SW480，SW620，LOVO，RKO）、8例正常结肠粘膜、15例结肠息肉和100例结直肠癌组织标本中DACH1的甲基化情况。应用SPSS13.0统计软件分析DACH1甲基化和结直肠癌临床病理学特点的相关性，P<0.05认为具有显著性统计学意义。应用免疫组织化学染色检测30例具有石蜡包块的结直肠癌组织和配对癌旁组织的DACH1、β-catenin和CyclinD1表达水平，探讨DACH1和后二者的相关性。应用荧光素酶报告基因检测方法，在结肠癌细胞系HCT116中检测DACH1对TGF-β和Wnt信号通路的影响；应用western blot检测DACH1表达对其下游蛋白（c-myc、CyclinD1等）的调控；通过克隆形成实验、细胞凋亡和细胞周期检测及体内成瘤实验探讨DACH1对结直肠癌的作用。结果5株结肠癌细胞系中，HCT116细胞系存在完全甲基化和表达缺失，经去甲基化药物5-aza处理后DACH1mRNA水平恢复表达；其余4株细胞系均为非甲基化且表达水平正常，5-aza处理前后mRNA表达无变化。在100例结直肠癌组织中，DACH1甲基化率为48%（48/100），在结肠息肉中为6.67%（1/15）,而在正常胃黏膜中无甲基化改变0%（0/8例）。结果表明DACH1甲基化与结肠癌肿瘤分级、分化和淋巴结转移密切相关（p<0.05）。双荧光素酶报告基因检测结果显示DACH1高表达能够抑制TGF-β和Wnt信号通路的活性。恢复HCT116中DACH1的表达可抑制克隆形成和细胞增殖。流式细胞分析显示G2/M期细胞增加，而对细胞凋亡无影响。Western Blot结果显示DACH1下调CyclinD1、c-myc和cdc2等下游蛋白的表达。DACH1能明显抑制裸鼠内HCT116细胞的成瘤能力。结论DACH1启动子区甲基化是结直肠癌的频发事件，并且调控DACH1的表达；DACH1甲基化与结肠癌肿瘤分级、分化和淋巴结转移密切相关。DACH1启动子区甲基化促进细胞周期和结肠癌细胞的增殖。启动子区域高甲基化导致的DACH1的表达缺失参与了TGF-β和Wnt信号通路在结直肠癌中的激活。DACH1表观遗传学改变可能成为结直肠癌早期诊断和预后的指标。恢复DACH1的表达可能用于结直肠癌的治疗。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 引言
• 第二章 DACH1 在结直肠癌细胞系中的表达及甲基化改变
• 第一节 试剂材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 实验试剂与耗材
• 第二节 实验方法
• 2.2.1 细胞培养及药物干预
• 2.2.2 细胞总 RNA 提取及 RT-PCR
• 2.2.3 细胞 DNA 提取及甲基化特异性 PCR（MSP）
• 2.2.4 亚硫酸盐基因组测序（Bisulfite genomic sequencing，BGS）
• 第三节 实验结果
• 2.3.1 DACH1 在结直肠癌细胞系中的甲基化改变
• 2.3.2 DACH1 在结直肠癌细胞系中的表达变化
• 第四节 讨论
• 小结
• 第三章 DACH1 在结直肠癌组织中的表达及甲基化改变与临床病理关系研究
• 第一节 试剂材料
• 3.1.1 组织标本
• 3.1.2 主要实验仪器和设备
• 3.1.3 实验试剂与耗材
• 第二节 实验方法
• 3.2.1 DACH1 免疫组织化学染色
• 3.2.2 结肠癌组织基因组 DNA 制备及 MSP
• 3.2.3 统计学处理
• 第三节 实验结果
• 3.3.1 DACH1 在结肠癌和癌旁组织中的表达差异
• 3.3.2 DACH1 在结肠癌组织标本中的甲基化改变
• 3.3.3.100 例结直肠癌患者 DACH1 甲基化状态与临床病理资料分析
• 第四节 讨论
• 小结
• 第四章 DACH1 对 TGF-β和 Wnt 信号通路的影响
• 第一节 试剂材料
• 4.1.1 实验材料及设备
• 4.1.2 实验试剂及耗材
• 第二节 实验方法
• 4.2.1 Western blot
• 4.2.2 双荧光素酶报告基因系统检测
• 4.2.3 免疫组织化学染色（IHC）
• 4.2.4 统计分析
• 第三节 实验结果
• 4.3.1 DACH1 抑制 TGF-β信号通路的活性
• 4.3.2 DACH1 抑制 Wnt 信号通路的活性
• 第四节 讨论
• 小结
• 第五章 DACH1 在体外、体内实验中的抑癌作用
• 第一节 试剂材料
• 5.1.1 实验材料和设备
• 5.1.2 实验试剂和耗材
• 5.1.3 实验动物
• 第二节 实验方法
• 5.2.1 细胞增殖实验
• 5.2.2 克隆形成实验
• 5.2.3 细胞凋亡及周期检测
• 5.2.4 Western blot 法检测 DACH1 及下游效应蛋白表达
• 5.2.5 裸鼠成瘤实验
• 5.2.6 统计分析
• 第三节 实验结果
• 5.3.1 DACH1 在体外实验中的抑癌作用
• 5.3.2 DACH1 在体内实验中的抑癌作用
• 第四节 讨论
• 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 文献综述（1）
• 参考文献
• 文献综述（2）
• Referenses
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢