论文摘要
为了研究SHP-1在细胞信号转导中的生物学功能,本文根据人SHP-1催化结构域（△SHP-1）基因设计,以SHP-1全酶基因为模板,通过PCR扩增其催化部位ΔSHP-1基因,并在其N末端引入Nde I限制酶位点,C末端引入Hind III酶切位点。将PCR扩增得到的ΔSHP-1基因连入用限制性内切酶EcoR V消化的克隆载体pKS中,经Nde I和Hind III双酶切。再用Nde I和Hind III双酶切质粒pKS-ΔSHP-1和表达载体pT7质粒,然后用T4 DNA连接酶将ΔSHP-1与表达载体pT7连接起来,经Nde I和Hind III双酶切,应用核酸电泳鉴定其大小正确。将表达载体转化到E. coliBL21中,获得了高表达菌株并进行了高效表达。然后应用离子交换方法,通过Q-Sepharose Fast Flow、SP-Sephadex两种离子交换柱,分离纯化得到目的蛋白ΔSHP-1。透析冻干后,经SDS-PAGE、HPLC分析鉴定,其纯度大于95% 。对ΔSHP-1的酶性质研究表明,当底物为p-NPP时,ΔSHP-1的最适pH为5.0,最适反应温度为36℃,最适离子强度为0;而在pH7.5,温度为15℃,离子强度为0条件下,对酶的活性影响最小。对其酶促反应进行动力学分析,得出Km=22.0mM,Vmax=2.901μmol/min。我们用纯化后的ΔSHP-1免疫家兔,获得的免疫血清通过PVDF固定抗原亲和层析柱制备并纯化得到了抗ΔSHP-1的抗体,经ECL检测,纯化前后抗体效价均可达到1:10000（V/V）;当抗原量为0.01μg时,可与纯化前的抗体特异性结合,当抗原量为1ng时,可与纯化后的抗体特异性结合,由此可见,抗体经过纯化,对抗原的灵敏度提高了10倍;全菌电泳Weston Blot检测,抗体纯度可达到90%以上,符合免疫实验要求。纯化后抗体血清经过56℃,30min加热灭活后,加入终浓度为1/1000的叠氮钠,分装小瓶,于-80℃低温保存。以上这些工作为在细胞水平上研究△SHP-1的生理功能以及发现它在细胞信号转导中的作用奠定基础。
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