化疗药物对癌干细胞多能性的影响及CSC小鼠模型的鉴定

论文摘要

第一部分低浓度化疗药物卡铂诱导癌干细胞产生最新研究表明癌症干细胞（cancer stem cell）存在于绝大部分的血液或实质肿瘤中。癌症干细胞具有自我更新self-renew的能力,且可以分裂分化成为成熟癌细胞并最终形成肿瘤。这些细胞对常规的临床抗癌治疗方法具有抗性。随着对癌干细胞在癌症发生发展过程中的基础性作用的认识和发现,癌干细胞的来源和形成越来越受到人们的关注。本研究的目的是检测化疗药物刺激后,癌细胞是否会获得类癌症干细胞的特性。实验结果证实,极低浓度的卡铂carboplatin可以刺激肝癌细胞加强自我更新（癌细胞球形成）和增强细胞多能性（Sox2和Oct3/4表达）。Sox2和Oct3/4表达被干扰后可以阻断这种诱导作用。进一步Hoechst33342染色和流式细胞分选获得非癌症干细胞后发现,用卡铂类似处理后的非癌干细胞也能被诱导产生干细胞特性。这一的数据显示在癌症发生发展中,高度分化的普通癌细胞也可能是癌干细胞的一个重要来源。扩展试验检测了多能性基因Sox2与Oct3/4被干扰后,癌细胞对化疗药物的抗性。结果表明干扰多能性基因的表达能提高癌细胞的敏感性,降低其对药物的耐受。因此多能性基因未来也许可以作为辅助的癌症治疗靶标,帮助杀灭癌干细胞,从而长期和根本上提高癌症的治愈率。第二部分癌干细胞研究小鼠模型的鉴定随着癌干细胞研究的深入,其在癌症病理发生及治疗过程中的作用越来越受到人们的重视。癌干细胞理论的提出和完善给癌症的彻底治愈带来无限希望。目前研究工作主要基于原代癌细胞,癌细胞系,或免疫缺陷裸鼠异皮质移植动物模型。尚无专用于癌干细胞研究的小鼠模型。APCmin/+小鼠模型具有自发性癌症发生,短生长周期,性状稳定等优势,是一个优秀的肠癌,结肠癌小鼠模型。尤其在WNT信号通路相关研究中具有不可替代的作用。本研究对不同年龄APCmin/+小鼠整个小肠肠道肿瘤根据大小分为大,中,小三组,在体式显微镜下,使用显微手术工具小心分离并收集组织样本,然后对各个组的组织进行活细胞分离。细胞经过无血清悬浮培养法检测其中癌症干细胞的多寡,结果显示,随着年龄的增长和癌症的恶化,癌干细胞的数量和比例呈上升趋势。其次对各组组织进行全蛋白抽提,Western Blotting检测其中干细胞基因Sox2,Oct4及β-catenin的表达水平变化,经过与内部参照基因GAPDH水平比较后发现,这些基因均存在不同程度的激活表达。趋势与干细胞数量增长一致,从分子水平上反应出癌症的恶化和癌干细胞的激活。最后,收集全小肠标本,制备整肠Swiss卷石蜡切片。用这些基因的抗体通过免疫组织化学染色的方法,检测Sox2,Oct4, c-Myc及β-catenin表达的部位,程度,分布情况。实验结果再一次确认了这些干细胞多能性基因的表达上调。其中Oct4增强程度强于Sox2.综上所述APCmin/+小鼠中伴随着癌症的白发发生和发展,癌症干细胞逐渐增多,多能性基因逐渐激活。说明癌干细胞在癌症发生发展中起着推动作用。同时APCmin/+小鼠模型不仅可以作为直肠癌模型,而且可以作为癌干细胞研究的动物模型,对CSC研究产生促进作用。

论文目录

• 中英文缩写表
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 化疗药物诱导癌干细胞的产生
• 第一章 前言和介绍
• 1.1 癌干细胞标志分子与SIDE POPULATION
• 1.1.1 标志分子
• 1.1.2 ABC基因家族与Side population
• 1.1.3 SP细胞与癌症干细胞
• 1.2 干细胞有关的多能性调控基因
• 1.3 癌细胞无血清悬浮培养与癌干细胞
• 1.4 简要技术流程
• 第二章 材料与方法
• 2.1 细胞的解冻，培养与传代
• 2.2 卡铂药物毒性分析
• 2.2.1 MTT 分析
• 2.2.2 台盼蓝活细胞计数
• 2.3 化疗药物对癌细胞进行处理及癌细胞球形成分析
• 2.3.1 无血清干细胞培养液的配制
• 2.3.2 化疗药物处理及成球分析
• 2.4 多能性基因表达的RNA水平分析
• 2.4.1 总RNA的提取
• 2.4.2 cDNA的合成
• 2.4.3 实时定量PCR（real-time PCR）
• 2.5 多能性基因表达的蛋白质水平检测
• 2.5.1 细胞总蛋白质的提取
• 2.5.2 蛋白质BCA法定量分析
• 2.5.3 蛋白质免疫印迹Western Blotting
• 2.6 HOECHST 33342染色与流式细胞分选
• 2.6.1 Hoechst 33342染色
• 2.6.2 流式细胞仪的参数设置
• 2.7 RNA干扰
• 第三章 结果与分析
• 3.1 低浓度与短时间化疗药物处理对有限杀伤肝癌细胞
• 3.2 低浓度卡铂刺激HEPG2和HUH7悬浮成球能力上升
• 3.3 低浓度卡铂药物处理后,多能性基因Sox2 AND OCT3/4显著上调
• 3.4 低浓度化疗药物诱导非癌干细成球能力上升
• 3.5 Sox2和OCT3/4干扰后影响细胞的成球能力
• 3.6 Sox2和OCT3/4干扰后降低肝癌细胞抗药性
• 第四章 讨论与展望
• 第二部分 癌干细胞小鼠模型的鉴定
• 第一章 前言和介绍
• 1.1 结肠癌及其分子机理
• 1.2 APC基因与WNT信号通路
• 1.3 结肠癌小鼠模型
• 第二章 材料与方法
• 2.1 APCmin+小鼠品系的繁殖维持和基因型鉴定
• 2.2 APCmin+小鼠肠道肿瘤活细胞的分离
• 2.3 APCmin+小鼠肠道肿瘤组织的蛋白提取和Westenr检测
• 2.4 APCmin+小鼠全小肠swiss卷切片与免疫组织化学检测
• 2.4.1 小鼠全小肠切片
• 2.4.2 免疫组化染色
• 第三章 结果与分析
• 3.1 APCmin+小鼠小肠中肿瘤的发生
• 3.2 APCMIN+小鼠肠癌中癌干细胞随着肿瘤的发生和恶化而增多
• 3.3 APCMIN+小鼠肠癌中癌干细胞随着肿瘤的发生和恶化干细胞基因逐渐激活
• 3.4 免疫组化检测小鼠肿瘤标本中多能性相关基因的表达
• 第四章 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录