弗氏链霉菌及耐热链霉菌的遗传改造

论文摘要

替米考星是一种重要泰乐菌素的衍生物，合成方法是通过水解泰乐菌素得到脱红霉糖泰乐菌素（desmycosin），然后以desmycosin为前体，通过胺化作用在泰乐菌素内酯环的C-20位置上加上一个3，5-二甲基哌啶基而成。泰乐菌素合成基因簇中红霉糖糖基转移酶合成基因tylCV的中断会导致desmycosin的累积。本研究结合SOE-PCR技术和PCR-targeting技术，建立了一种新的链霉菌快速基因中断方法。以泰乐菌素工业生产菌株BIB1028为出发菌株，首先通过SOE-PCR技术构建tylCV基因中断结构，将oriT-aac（3）Ⅳ中断盒按开放阅读框完全置换tylCV基因，然后通过弗氏链霉菌—大肠杆菌属间接合转移将该中断结构导入BIB1028，通过同源重组置换tylCV基因，得到重组突变株BIB715。通过nested-PCR对tylCV基因置换进行了验证，摇瓶发酵结果显示tylCV基因中断导致发酵产物主要为desmycosin。通过FLP重组酶作用于tylCV基因中断结构中的FRT位点，得到tylCV发生读码框缺失的基因置换结构，将该置换结构插入接合转移载体pBIB1015，通过弗氏链霉菌—大肠杆菌属间接合转移将该基因置换结构导入BIB715，通过同源重组得到tylCV基因发生读码框缺失的重组突变株BIB1209。通过PCR、RT-PCR对置换结果进行了验证，摇瓶发酵实验结果显示主要发酵产物亦为desmycosin。摇瓶菌种筛选以后，在5L发酵罐上对出发菌株BIB1028和两突变株BIB715和BIB1209进行了发酵试验，参照泰乐菌素的发酵工艺，desmycosin的产量分别达到7.3g／l和7.0g／l，相比出发菌株的9.1g／l，通过折算，两突变株的产能达到出发菌株的106±5％。而且和出发菌株的四种组分（泰乐菌素A、脱红霉糖泰乐菌素B、大霉素C和雷洛菌素D）相比，两重组突变株的组分主要有两种（desmycosin和lactenocin），通过提取后，desmycosin能够占到总产量的95％，组分更加单一。我们还对替米考星的合成方法进行了探讨，与传统合成以泰乐菌素成品—磷酸泰乐菌素为出发原料相比，本研究中所得重组突变株通过发酵得到的desmycosin只需要经过两三步简单处理就可以将90％以上的desmycosin转移至有机相进行替米考星的合成。与传统泰乐菌素的70～80％回收率相比，不但简化了反应步骤，而且提高了得率。HPLC-MS结果显示：合成的替米考星与工业生产的替米考星结构完全一致。乙酰异戊酰泰乐菌素（AIV）是另一种重要的泰乐菌素衍生物，它是通过耐热链霉菌生物转化泰乐菌素，在泰乐菌素的3’-羟基位置乙酰基化和4”-羟基位置异戊酰基化而得。通过优化，本研究首次建立了优化的耐热链霉菌—大肠杆菌接合转移系统，整合表达了血红蛋白基因（vhb），摇瓶发酵结果显示血红蛋白基因的表达对耐热链霉菌转化泰乐菌素几乎没有影响。通过PCR-targeting和在弗氏链霉菌中应用的快速基因中断法对负责相应酰基化功能的acyB1-B2基因进行了功能研究，先后得到acyB1-B2基因中断菌株、acyB1基因中断菌株，并对相应中断菌株进行了互补，得到相应的基因互补菌株。研究表明：acyB1基因的中断对acyA基因功能没有影响，而以前报道的acyB1的正调控基因acyB2的中断会导致了acyA基因表达水平的下降95％以上。研究表明acyB2基因应该是碳霉素生物合成基因簇中的一个全局性正调控因子，它不仅负责对acyB1基因的正调控作用，而且还至少负责对acyA基因和红霉糖糖基转移酶基因的正调控。在耐热链霉菌中存在两个抗性基因，分别为carA和carB，其中carA类似泰乐菌素的tlrC，为ATP结合转运蛋白；CarB为核糖体单甲基化酶，类似泰乐菌素的tlrB。为提高AIV生物转化过程中菌体对泰乐菌素的抗性，通过整合表达红霉素抗性基因（ermE），抗性平板结果显示耐热链霉菌对泰乐菌素的抗性提高四倍以上，而相应的酰基化功能没有变化，这对解决工业生产上底物投料浓度问题有一定的帮助。本研究还对在链霉菌中普遍存在的负调控基因nsdA（negative regulator of Streptomyces differentiation）进行了研究。通过PCR-targeting的方法对耐热链霉菌的nsdA基因进行了中断，得到相应的突变株。摇瓶发酵结果显示：耐热链霉菌nsdA基因的中断可以提高其酰基化酶的酶活，与出发菌株相比，在摇瓶水平，在相同投料浓度下，nsdA中断株AIV的转化率从82％提高到93％。本研究还对耐热链霉菌的底物耐受性进行了探索，得到了乙酰脱红霉糖泰乐菌素和一种新的替米考星衍生物。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语（Abbreviation）
• 第一章 泰乐菌素文献综述
• 1.1 泰乐菌素生物合成
• 1.1.1 泰乐内酯（tylactone）的生物合成
• 1.1.2 泰乐内酯的后修饰（Post-PKS tailoring）
• 1.1.2.1 碳霉氨基糖的生物合成
• 1.1.2.2 红霉糖的生物合成
• 1.1.2.3 5’-脱氧-D-阿洛糖的生物合成
• 1.1.3 甲基转移酶基因tylE和tylF
• 1.1.4 泰乐菌素抗性基因tlrA、tlrB、tlrC和tlrD
• 1.1.5 泰乐菌素生物合成的调控
• 1.1.5.1 tylS和tylU
• 1.1.5.2 tylP和tylQ
• 1.1.5.3 tylR
• 1.1.6 辅助基因metF和metK
• 1.2 泰乐菌素的遗传改造
• 1.2.1 限速酶基因的克隆与表达:tylF基因
• 1.2.2 碳霉氨基糖的改造
• 1.3 泰乐菌素的生物转化与半化学合成
• 1.3.1 AIV
• 1.3.2 Tilmicosin
• 本课题研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 PCR引物
• 2.1.4 培养基和生化试剂
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种培养及保藏
• 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的小量提取
• 2.2.3 大肠杆菌感受态的制备及质粒的化学转化
• 2.2.4 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测
• 2.2.5 链霉菌总DNA的少量快速提取
• 2.2.6 链霉菌总RNA的快速提取
• 2.2.7 PCR
• 2.2.8 RT-PCR
• 2.2.9 DNA片段的回收
• 2.2.10 载体的去磷酸化
• 2.2.11 DNA连接
• 2.2.12 PCR介导的定向基因置换技术
• 2.2.13 大肠杆菌与链霉菌之间的属间接合转移
• 2.2.14 发酵培养
• 2.2.15 菌体浓度的测定
• 2.2.16 泰乐菌素及其衍生物的测定
• 第三章 泰乐菌素组分的遗传改造
• 3.1 tylCV基因的中断
• 3.1.1 引言
• 3.1.2 基因中断和基因置换的基本原理
• 3.1.3 PCR介导的基因中断&基因置换的基本原理
• 3.1.4 SOE-PCR构建基因中断&置换载体的原理
• 3.1.5 SOE-PCR构建tylCV基因置换载体
• 3.1.5.1 tylCV基因两侧交换臂及acc（3）IV抗性盒PCR扩增
• 3.1.5.2 SOE-PCR构建tylCV基因置换结构
• 3.1.5.3 基因置换载体的构建
• 3.1.6 tylCV基因置换载体导入弗氏链霉菌
• 3.1.7 筛选双交换菌株
• 3.1.8 tylCV基因置换的PCR验证
• 3.1.9 tylCV基因置换菌株发酵产物的HPLC和HPLC-MS分析
• 3.1.10 tylCV基因置换菌株的筛选
• 3.2 tylCV基因的读码框缺失
• 3.2.1 引言
• 3.2.2 tylCV读码框缺失基因置换载体的构建
• 3.2.2.1 穿梭载体pBIB1015的构建
• 3.2.2.2 pBIB605导入BT340处理
• 3.2.2.3 tylCV读码框缺失置换载体PBIB1017构建
• 3.2.3 tylCV读码框缺失基因置换载体导入BIB715
• 3.2.4 筛选双交换菌株
• 3.2.5 tylCV读码框缺失菌株的PCR验证和RT-PCR验证
• 3.2.6 tylCV基因读码框缺失菌株筛选
• 3.3 BIB715和BIB1209的发酵罐发酵分析
• 3.4 替米考星合成的小试
• 3.4.1 泰乐菌素B的提取
• 3.4.2 泰乐菌素B合成替米考星
• 第四章 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.2 讨论
• 4.3 未来工作
• 第五章 耐热链霉菌酰基化酶基因功能研究
• 5.1 耐热链霉菌接合转移系统的构建
• 5.1.1 引言
• 5.1.2 接合转移体系的组成
• 5.1.3 大肠杆菌—耐热链霉菌接合转移系统的构建及血红蛋白基因（vhb）表达
• 5.1.4 vhb基因表达对耐热链霉菌转化泰乐菌素的影响
• 5.2 耐热链霉菌acyB1-B2基因中断对其酰基化泰乐菌素的影响
• 5.2.1 引言
• 5.2.2 acyB1-B2基因中断载体的构建
• 5.2.2.1 acyB1-B2基因中断交换臂及acc（3）IV抗性盒PCR扩增
• 5.2.2.2 SOE-PCR构建acyB1-B2基因中断载体
• 5.2.3 acyB1-B2基因中断载体导入耐热链霉菌
• 5.2.4 筛选双交换菌株
• 5.2.5 acyB1-B2基因中断的PCR验证
• 5.2.6 acyB1-B2基因中断对转化泰乐菌素的影响
• 5.3 耐热链霉菌acyB1基因中断对其酰基化泰乐菌素的影响
• 5.3.1 PCR扩增条件
• 5.3.2 抗性标记置换pBIB303上的acyB1片段
• 5.3.3 acyB1基因中断载体构建及接合转移
• 5.3.4 筛选双交换菌株
• 5.3.5 acyB1基因中断对转化泰乐菌素的影响
• 5.4 耐热链霉菌突变株BIB302和BIB303基因互补实验
• 5.4.1 互补表达载体的构建
• 5.4.2 互补表达载体导入耐热链霉菌突变株
• 5.4.3 基因互补对转化泰乐菌素的影响
• 5.5 acyB2基因对红霉糖糖基转移酶的正调控作用
• 5.5.1 BIB2001转化替米考星和泰乐菌素B
• 5.5.2 BIB302与BIB305转化替米考星
• 5.6 红霉素抗性基因ermE在耐热链霉菌中的表达
• 5.6.1 红霉素抗性基因ermE表达载体构建
• 5.6.2 ermE表达载体pBIB312接合转移BIB2001
• 5.6.3 ermE整合表达对耐热链霉菌的影响
• 5.7 nsdA基因中断对耐热链霉菌转化泰乐菌素的影响
• 5.7.1 耐热链霉菌中nsdA基因的验证
• 5.7.2 耐热链霉菌中nsdA基因中断载体的构建
• 5.7.3 接合转移
• 5.7.4 筛选双交换菌株
• 5.7.5 双交换菌株的PCR验证
• 5.7.6 nsdA基因中断对耐热链霉菌转化泰乐菌素的影响
• 第六章 总结与讨论
• 6.1 总结
• 6.2 讨论
• 参考文献
• 致谢