铜绿假单胞菌Las系统信号分子对小鼠巨噬细胞的影响

论文摘要

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）俗称绿脓杆菌,属革兰阴性杆菌,广泛分布于水、空气、土壤及医院环境中,同时也是人体的正常菌群。本菌的感染多见于皮肤粘膜受损部位,如烧伤、创伤等,也见于因长期化疗或使用免疫抑制剂的患者。在医源性感染中由本菌引起者约占10%,在某些特殊病房中,如烧伤和肿瘤病房、各种导管和内窥镜的治疗与检查室内,本菌感染率可高达30%。它是一种能引起急慢性感染的机会致病菌,特别是引起肺部感染。它是引起囊性肺纤维化、弥漫性泛支气管炎及支气管扩张症等病人死亡的主要病原体。由于其对抗生素的耐药性使其感染几乎不可能被清除而导致肺衰竭最终导致死亡。这促使人们开始致力于研究其感染的机制,从而从根本上寻找新的抗感染途径。近年来的研究发现细菌可以根据特定信号分子的浓度来监测周围环境中自身的数量变化,当信号分子达到一定的阈值浓度时,可与相应受体结合,激活菌体中相关基因的表达来适应环境中的变化,完成这一信号传导的普遍存在于革兰阴性菌和革兰阳性菌中的系统被称为细菌密度感知信号（Quorum-sensing,QS）系统。在革兰阴性菌中,对QS系统研究最为深入的是铜绿假单胞菌,该菌的信号系统在调控铜绿假单胞菌各种毒力因子表达中起重要作用。随着对该系统的深入研究,已经证实细菌细胞间信号系统是由参与毒力基因表达的调控多基因组成的,同时也明确了细胞间信号系统基因群是一个复杂的级联系统。这个级联系统包括两个主要的转录调节因子lasR和rhlR和几个其它组成元素。近年来又发现了铜绿假单胞菌的由QS系统控制并且调控lasB的转录的喹诺酮信号级联系统。目前的研究成果表明,Las系统在铜绿假单胞菌QS系统中位于信号级联系统的顶层。LasR-3-oxo-C12-HSL复合物可以正向调控rhlR和rhlI的转录;喹诺酮信号系统中的醌类物质（PQS）是连接Las系统和Rhl系统的纽带。不论在哪一个细胞间信号系统中,Las系统均处于中心地位。当细菌密度较低的时候,仅产生基础水平的3-oxo-C12-HSL,当密度升高时,3-oxo-C12-HSL亦随之升高直至阈值浓度,此时3-oxo-C12-HSL便和LasR结合,LasR-3-oxo-C12-HSL复合体主导网络调控并激活下游特定基因的转录,从而激活包括绿脓菌素等在内的一系列致病因子的表达。近年来已有研究提示密度感知系统本身就可能是一种毒力因子,并且可以直接作用于宿主细胞,抑制宿主免疫反应,从而导致机体更易于被感染。综合以前学者的研究讨论工作,强烈提示信号分子能够改变铜绿假单胞菌感染后的宿主免疫反应并可能是宿主免疫应答反应的重要调节因子。宿主体内存在着比较完善的免疫系统。该系统由免疫器官、免疫细胞以及免疫分子组成。在感染免疫过程中,各免疫器官、组织、细胞和免疫分子间互相协作、互相制约、密切配合,共同完成复杂的免疫防御功能。而致病菌侵入人体后,首先遇到的是固有免疫功能的抵御。固有免疫主要由组织屏障和某些免疫细胞、免疫分子等组成。而巨噬细胞作为机体重要的分泌细胞因子的固有免疫应答细胞,具有吞噬颗粒性抗原及吞饮可溶性抗原的作用。此外,巨噬细胞作为炎症阶段的主要吞噬细胞,负责清除机体损伤处组织和细胞的坏死碎片以及病原体等,这些物质对创伤愈合过程都有重要的调控作用。因此,巨噬细胞的活化对于机体早期抗感染免疫具有一定作用。故以巨噬细胞凋亡和吞噬等细胞行为学变化为研究靶点,可成为筛选和开发新型免疫调节药物的新策略。我们通过化学合成铜绿假单胞菌Las系统信号分子3-oxo-C12-HSL分子,观察其对小鼠巨噬细胞株RAW264.7的基本生物效应,为进一步研究细菌与宿主之间相互作用提供初步实验依据。本研究工作分以下二个部分:一、铜绿假单胞菌Las系统信号分子3-oxo-C12-HSL对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞活力及凋亡影响的检测1、铜绿假单胞菌Las系统信号分子3-oxo-C12-HSL对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞活力影响的检测挑选一瓶状态好的细胞用0.25%的胰酶消化吹打混匀成密度约为8×106/ml的细胞悬液,以200μL/孔的量接种到96孔培养板中（周边孔用PBS填充）37℃5%CO2培养箱中培养过夜后,细胞贴壁生长,将孔板中的培养基弃去,加入不含胎牛血清的DMEM200μL/孔,各孔分别加入信号分子3-oxo-C12-HSL使其终浓度为100,50,25,12.5,6.25μM及对照孔（加等量的DMSO）,每组设6个复孔,信号分子3-oxo-C12-HSL作用2h或4h后吸去孔中培养基,用PBS洗两遍,然后加入180μL/孔不含胎牛血清的DMEM并同时加入20μL/孔MTT,继续培养4h,4h后将上清弃去,每孔加入DMSO150μL,低速振荡10min,使结晶充分溶解后在酶标仪上测各孔的OD490nm。通过得到的各孔OD值的大小间接反映各孔细胞的活力。2、铜绿假单胞菌Las系统信号分子3-oxo-C12-HSL对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞凋亡的影响挑选一瓶状态好的细胞用0.25%的胰酶消化吹打混匀成密度合适的细胞悬液（8×106/ml）,以3ml/孔的量接种到6孔板中37℃5%CO2培养箱中培养过夜后,细胞贴壁生长,将孔板中的培养基弃去,加入新鲜的培养基同时加入信号分子3-oxo-C12-HSL使其终浓度为100,50,25,12.5,6.25μM及对照孔（加等量的DMSO）,作用4h后按照AnnexinⅤ-FITC/PI双标凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）及Caspase 3,8,9活性检测试剂盒说明操作,分别上流式、酶标仪或荧光显微镜检测结果,比较不同浓度信号分子引起细胞的凋亡情况。二、铜绿假单胞菌Las系统信号分子3-oxo-C12-HSL对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞吞噬功能的影响1、铜绿假单胞菌Las系统信号分子3-oxo-C12-HSL对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞吞饮中性红的影响挑选一瓶状态好的细胞用0.25%的胰酶消化吹打混匀成密度约为8×106/ml的细胞悬液,以200μL/孔的量接种到96孔培养板中（周边孔用PBS填充）37℃5%CO2培养箱中培养2h后细胞贴壁,加入信号分子3-oxo-C12-HSL使其终浓度为100,50,25,12.5,6.25μM及对照孔（加等量的DMSO）,继续孵育2h,弃去培养基加入中性红生理盐水（0.7%）200μL/孔37℃5%CO2培养箱中孵育1h,用PBS洗三次,然后加入细胞裂解液200μL/孔,4℃过夜。酶标仪测定各孔的OD490nm。间接反映各孔细胞对中性红的吞饮能力。2、铜绿假单胞菌Las系统信号分子3-oxo-C12-HSL对小鼠巨噬细胞株RAW264.7吞噬铜绿假单胞菌的影响挑选一瓶状态好的细胞用0.25%的胰酶消化吹打混匀成密度合适的细胞悬液（8×106/ml）,以3ml/孔的量接种到6孔板中37℃5%CO2培养箱中培养过夜后,细胞贴壁生长,将孔板中的培养基弃去,加入新鲜的培养基同时加入信号分子3-oxo-C12-HSL使其终浓度为100,50,25,12.5,6.25μM及对照孔（加等量的DMSO）,作用2h,然后加入0.2ml/孔的PAO1生理盐水铜绿假单胞菌悬液（铜绿假单胞菌数量与细胞数的比例约为100:1）,与细胞37℃共孵育1h后用PBS充分洗三次,瑞氏染色后在油镜下观察计数分别得到吞噬率和吞噬指数。结论:本研究通过对加不同浓度3-oxo-C12-HSL后的小鼠巨噬细胞的形态学、细胞膜、线粒体、caspase酶活性及其吞噬能力的变化,说明铜绿假单胞菌Las系统信号分子3-oxo-C12-HSL对小鼠巨噬细胞株RAW264.7具有免疫抑制作用,可以降低巨噬细胞对其感染的免疫反应。此结果为进一步研究细菌与宿主之间相互作用提供了初步的实验依据。如果应用于临床,可以成为筛选和开发新型免疫调节药物的新策略。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 主要缩略词
• 致谢