先天性巨结肠症血清蛋白质标记物的检测

论文摘要

先天性巨结肠症（Hirschsprung disease，HSCR）是一种先天性肠道神经节细胞缺乏症，又称无神经节细胞症（Aganglionosis），1886年丹麦医生Harald Hirschsprung首先提出其特发性的先天病理改变，1945年Swenson对HSCR作出了根本性论断，即病变肠管肌间神经丛中神经节细胞缺如，肠管不能舒张如“痉挛”肠管，其近段肠管继而增大。HSCR是小儿外科常见的消化道畸形，在先天性消化道畸形中发病率居第二位，发病率约为1/5000～1.76/10000，男女比例约为4：1，男性多见。HSCR的病因和发病机制目前尚不明确，普遍认为是多种因素共同作用的结果，如缺血、缺氧、病毒、毒素、遗传等。各种因素作用于神经发育不同阶段，抑制了神经节细胞的发育。可概括以下三种情况：1、神经嵴细胞迁移障碍。胚胎期神经嵴细胞分化及向肠壁内移行停顿所致。认为是一种多基因遗传疾病，相关基因突变或/和表达异常使神经嵴细胞发育、迁移受阻而发生HSCR，目前研究认为RET基因起关键作用。其他研究较多的还有GDNF，EDNR，NCX等。2、微环境因素阻止神经节细胞的正常发育。如胞外基质蛋白、神经生长因子及其受体的改变，影响了神经嵴细胞的存活和发育。3、某些局部因素。如缺血、缺氧、免疫因素、巨细胞病毒和寄生虫感染等毁坏了肠壁内神经嵴细胞。HSCR术前诊断主要依据临床症状结合对比灌肠造影（CE）、直肠肛管测压（ARM）、直肠黏膜吸引活检（RSB）、肠肌电图等辅助检查。CE诊断准确率约45.24％～80％。新生儿期钡剂灌肠结肠造影时，痉挛段、移行段及扩张段分界不清，X线表现不典型。钡剂灌肠时由于清洁肠道、肛管内注入气泡等而出现“假性巨结肠”表现；钡剂过稀出现水中毒，严重时危及患儿生命：若检查前合并小肠结肠炎患儿易致肠穿孔造成钡剂性腹膜炎。ARM对HSCR诊断准确率约为64.3％～71.43％。直肠黏膜吸引活检（RSB）吸引的压力不易掌握，压力过低吸取不到黏膜或者黏膜厚度不够，压力过高有直肠穿孔的危险。肠肌电图检查虽操作简单，无痛苦，可反复检查，但肌电图的生理差异较大，各种波形判断存在一定技术误差，且受肠内粪便、小儿哭闹和外括约肌肌电波形的影响，因而准确率较低。目前，先天性巨结肠症的研究主要集中在病因学尤其是基因遗传学方面，对于先天性巨结肠症的诊断方法的研究国内外尚未见有新报道。而目前的诊断方法尚无法满足临床无创，简便，高效，快速的早期诊断要求，因此，探讨一种特异性强、灵敏性高、无创的诊断方法成为必需。SELDI-TOF-MS技术是2002年开发的新型蛋白质组学技术，应用基因芯片的设计原理，把层析、质谱等技术合理地与蛋白质芯片结合，可检测出传统方法很难鉴定的蛋白质和多肽，具有快速、灵敏、高通量等特点，在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌等的标记物筛选和早期诊断研究方面已经取得重大突破。研究目的检测先天性巨结肠症患儿血清蛋白质，筛选特异的蛋白质标记物，构建用于先天性巨结肠症早期筛选及诊断的血清蛋白质指纹图谱模型。材料与方法1．材料1．1标本78例血清标本：先天性巨结肠症42例，其他类型肠梗阻16例（阑尾炎术后肠梗阻8例、美克尔憩室术后肠梗阻3例、炎症性肠梗阻5例），正常对照组20例。所有先天性巨结肠症标本均经病理学结果证实。先天性巨结肠症中男33例，女9例，年龄3d-18a。正常对照组与先天性巨结肠症组年龄、性别相匹配。1．2设备表面增强激光解析电离—飞行时间质谱（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight-Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS），PBSⅡ+ Ciphergen Inc．美国)。主要参数：收集范围为1000-50000；优化范围为2000-30000。1．3芯片弱阳离子交换（WCX2）蛋白质芯片。1．4应用软件和标记物评价指标应用软件：Proteinchip Software 3.1，Biomarker Wizard和ZUCI-ProteinChip Data Analyze System软件包。支持向量机（SVM）：MATLAB6.5OSU-SVM工具箱。评价实验的指标：灵敏性、特异性、Youden指数。2．方法2．1血清样本处理：U9溶液处理冰浴中解冻的血清标本，100Mm NaNC（PH=4）稀释后，和Bioprocessor预处理过的WCX2蛋白芯片结合反应60分钟，上述NaNC缓冲液清洗芯片，取出芯片风干后点50％饱和的SPA溶液，上机读片。2．2 SELDI操作：SELDI质谱仪完成设置后，记录每一例样本的血清蛋白质质谱图。原始数据先用Proteinchip Software 3.1做校正，使总离子的强度及分子量均一化。用Biomarker Wizard和ZUCI-ProteinChip Data Analyze System软件包过滤噪音局部极值的方法找出样本各自的峰，并过滤信噪比小于2的峰，以10％为最小阈值做聚类分析，得到初步筛选结果。2．3血清样本分组：☆组1：先天性巨结肠症组与正常对照组的比较☆组2：其他类型肠梗阻组与正常对照组的比较2．4建模方法：对初步筛选出来的质荷比峰做Wilconxon秩和检验，筛选每组有统计学意义的m/z值。将有显著差异的m/z值数据输入支持向量机进一步分析，用训练集建立判别模型，用测试集检验模型的效力，筛选用于建模的m/z值。评价模型的敏感性、特异性。结果1．先天性巨结肠症组与正常对照组42例先天性巨结肠症和20例正常对照血清标本检测的质谱数据经过初步过滤筛选得到213个M/Z峰，对其相对强度做wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M/Z峰13个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的youden指数最高的组合模型，筛出M/Z位于3221.7、5639.2和6884.2的标志物3个，在先天性巨结肠症组低表达，在正常对照组高表达。联合三个潜在标记物作为输入值，留一法交叉检测，在测试集上判别模型的特异性为100％，敏感度为100％。2．其他类型肠梗阻组于正常对照组16例其他类型肠梗阻组（阑尾炎术后肠梗阻8例、美克尔憩室术后肠梗阻3例、炎症性肠梗阻5例）和20例正常对照组血清标本检测的质谱数据经过对比发现，在M/Z位于3221.7、5639.2和6884.2的3个血清蛋白质标志物处，两组检测结果无显著性差异。结论SELDI-TOF-MS结合SVM建立先天性巨结肠症血清蛋白质指纹图谱模型是早期筛选及诊断先天性巨结肠症的一种特异性强、敏感性高的新方法，值得进一步研究和应用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 先天性巨结肠症血清蛋白质标记物的检测
• 研究背景
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 附表
• 参考文献
• 综述部分
• SELDI蛋白质芯片技术研究进展及其在临床研究中的应用
• 参考文献
• 缩略词
• 在读期间发表及待发表文章
• 致谢