Eg5基因表达调控及其抑制剂抗胰腺癌作用的分子机制

论文摘要

在细胞分裂过程中,有丝分裂纺锤体控制染色体的分离。纺锤体是具有双极性的结构,由微管和微管结合蛋白组成。纺锤体的双极性对于染色体的精确分离是必需的,而双极性的形成则依赖于微管依赖性马达蛋白。Eg5是属于驱动蛋白家族的一个马达蛋白,在双极纺锤体的组装过程中发挥关键作用。除了在纺锤体组装中起作用之外,最近的研究表明Eg5可能通过影响基因组的稳定性,参与肿瘤的发生发展。但是,关于Eg5在细胞中的表达是如何被调控的一直不清楚。另外,抑制Eg5活性的小分子化合物作为治疗癌症的新一代药物是当前研究的热点,有些Eg5抑制剂已经作为癌症化疗药物进入临床试验阶段。由于Eg5主要在处于分裂中的细胞内起作用,在分裂后的神经细胞中很难被检测到,因此在癌症治疗中Eg5抑制剂可能具有比微管抑制剂（常引起神经毒性）更好的特异性。至于Eg5抑制剂在胰腺癌这一恶性肿瘤中起什么作用,目前尚不清楚。本论文对Eg5基因表达调控及其抑制剂抗胰腺癌作用的分子机制进行了研究,以加深对Eg5基因表达及其功能的理解,并为Eg5抑制剂在胰腺癌治疗上的应用提供理论依据。在第一部分,本研究发现细胞中Eg5的表达水平受到E3泛素连接酶Parkin的负调控,Parkin不是通过泛素.蛋白酶体途径来促进Eg5的降解,而是通过阻止转录因子c-Jun与Eg5启动子上的AP1位点的结合来抑制Eg5基因的转录。进一步研究发现,Parkin使蛋白激酶JNK失活,从而导致c-Jun的磷酸化程度降低,而JNK的失活则依赖于Parkin对Hsp70在多个位点的单泛素化。Hsp70的单泛素化和随后的JNK-c-Jun途径的失活对于Parkin下调Eg5的表达都是十分重要的。这些结果揭示了Parkin的一个新功能,即通过Hsp70-JNK-c-Jun信号途径调节Eg5的基因表达。在第二部分,本研究发现Eg5的小分子抑制剂能阻断胰腺癌细胞进行有丝分裂,抑制胰腺癌细胞的增殖,进而诱导细胞凋亡的发生。Eg5抑制剂所引起的有丝分裂的阻断归因于其对纺锤体形成的影响和对纺锤体检验点的激活。进一步研究发现,纺锤体检验点的损伤可以显著地削弱Eg5抑制剂对有丝分裂的阻断及其对细胞凋亡的诱导,表明纺锤体检验点可以调节胰腺癌细胞对Eg5抑制剂的敏感性。此外,利用荷人胰腺癌的裸鼠,本研究发现Eg5抑制剂通过引起细胞的凋亡,阻止裸鼠体内胰腺癌的生长。这些结果表明Eg5是胰腺癌治疗的一个潜在靶点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 第一节 驱动蛋白和有丝分裂
• 1.1.1 驱动蛋白简介
• 1.1.2 有丝分裂
• 1.1.3 驱动蛋白在有丝分裂中的作用
• 第二节 Eg5的结构和功能
• 1.2.1 Eg5的基因定位和结构
• 1.2.2 Eg5在有丝分裂中的作用
• 1.2.3 Eg5与肿瘤发生发展
• 第三节 泛素连接酶Parkin
• 1.3.1 泛素-蛋白酶体降解途径
• 1.3.2 Parkin的结构与功能
• 第四节 纺锤体检验点
• 1.4.1 细胞周期的检验点
• 1.4.2 纺锤体检验点
• 1.4.3 纺锤体检验点与肿瘤化疗
• 第五节 Eg5抑制剂
• 1.5.1 代表性Eg5抑制剂
• 1.5.2 Eg5抑制剂的优点
• 第六节 胰腺癌及其治疗
• 第七节 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 第一节 实验材料
• 2.1.1 细胞系
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 分子克隆所用的酶
• 2.1.5 小分子RNA
• 2.1.6 抗体
• 2.1.7 化合物
• 第二节 实验方法
• 2.2.1 分子克隆
• 2.2.2 PCR反应
• 2.2.3 细胞培养
• 2.2.4 质粒转染
• 2.2.5 siRNA转染
• 2.2.6 病毒扩增
• 2.2.7 荧光素酶报告基因实验
• 2.2.8 Western blotting
• 2.2.9 免疫沉淀
• 2.2.10 免疫荧光染色
• 2.2.11 蛋白质翻转实验
• 2.2.12 流式细胞术分析细胞周期
• 2.2.13 MPM2染色实验
• 2.2.14 Annexin V染色实验
• 2.2.15 Caspase-3活性检测
• 2.2.16 实时定量PCR
• 2.2.17 蛋白质-寡核苷酸结合实验
• 2.2.18 JNK免疫复合物激酶活性检测
• 2.2.19 体外细胞增殖实验
• 2.2.20 裸鼠实验
• 2.2.21 肿瘤切片的TUNEL染色
• 第三章 Parkin对Eg5基因表达的调控及其分子机制
• 第一节 Parkin下调Eg5的表达
• 第二节 Parkin对Eg5表达的下调不依赖于泛素-蛋白酶体途径
• 第三节 Eg5在转录水平上受到Parkin的下调
• 第四节 Parkin通过抑制JNK-c-Jun信号途径降低Eg5基因的表达
• 第五节 Parkin泛素化Hsp70对Parkin灭活JNK及降低Eg5表达很重要
• 第四章 Eg5抑制剂的抗胰腺癌作用及其分子机制
• 第一节 Eg5抑制剂阻止胰腺癌细胞的增殖
• 第二节 Eg5抑制剂阻止胰腺癌细胞在有丝分裂期并影响双极纺锤体形成
• 第三节 Eg5抑制剂在胰腺癌细胞中激活纺锤体检验点
• 第四节 Eg5抑制剂诱导胰腺癌细胞凋亡
• 第五节 纺锤体检验点完整性影响胰腺癌细胞对Eg5抑制剂的敏感性
• 第六节 Eg5抑制剂在裸鼠体内阻止胰腺癌生长
• 第五章 讨论
• 第一节 Eg5基因表达调控机制
• 第二节 Eg5抑制剂的抗胰腺癌作用
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录1:个人履历
• 附录2:在学期间发表的论文
• 附录3:英文缩写
• 致谢