论文摘要
癫痫是由于脑部兴奋性过高的某些神经元突然异常放电引起的脑功能异常,是一种常见的慢性临床综合征。临床发现30%～40%的癫痫患者除癫痫发作症状外,常伴有记忆力减退、注意力分散等认知功能受损的表现,严重影响了患者的生活质量。癫痫与认知功能损害的关系已被人们广泛重视,并已成为现代癫痫病学研究的热点之一,但癫痫后认知功能损害的机制还不清楚。目前认为,突触是神经元之间结构和功能的接触点,是神经信息传递的关键部位,突触结构和功能的完整对于保证神经元获得信息并顺利进行信息传递、加工和贮存是非常重要的。突触可塑性是指突触在一定条件下通过改变形态而调整功能的能力,在神经系统的发育、成熟及学习记忆等生理过程中起重要作用。突触可塑性变化主要表现在突触囊泡数密度（synaptic vesicles density, SVD）、突触间隙的宽度（the width of synaptic cleft, WSC）及突触后膜致密物（postsynaptic density, PSD）的厚度等方面的变化。突触可塑性和海马的长时程增强（long-term potentiation,LTP）密切相关,LTP反映突触水平的信息存储过程,是学习记忆的分子基础。突触素（synaptophysin, SYN, P38）作为突触囊泡的特异性标志蛋白,其密度和分布可间接反映体内突触的数量和分布情况,与突触重建及认知过程密切相关。突触后致密物95（postsynaptic density 95, PSD-95）串集N-甲基-D-门冬氨酸（N-methy1 -D-aspartate, NMDA）受体,而此受体是诱发LTP的必要条件。LTP的形成是突触前后机制共同作用的结果。P38反映了突触前膜递质的释放,PSD-95反映了突触后膜受体的有效性。钙作为神经信号传递的重要信使,参与了学习记忆的神经机制,神经细胞内钙离子浓度（intracellular concentration of calcium, [Ca2+]i）的微小变化就可以引起一系列生理乃至病理性改变。Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα（calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIα, CaMK IIα）是海马内含量最高的一种蛋白,也是PSD的主要成分,其自动磷酸化与LTP的维持（<3小时）密切相关,更长时间的LTP的维持需要一系列基因的表达和新蛋白质的合成,而环磷腺苷反应单元结合蛋白（cAMP response element binding protein, CREB）是细胞内的转录转导因子,调节基因的转录和蛋白质的合成,是短时记忆向长时记忆转化的关键。癫痫作为高频刺激（high frequency stimulation, HFS）,可以引起谷氨酸大量释放,钙离子内流,诱导兴奋性氨基酸毒性作用及钙超载,频繁HPS是否引起学习记忆能力下降,钙信号如何沿Ca2+-CaMK II-CREB传递,同时,调节谷氨酸释放的突触前膜囊泡（P38）及固定谷氨酸受体的突触后膜成分PSD-95如何变化,突触超微结构发生了什么改变,所有这些我们并不清楚,而这些可能为研究癫痫后认知功能障碍的机制找到一些新的突破点。尼莫地平（nimodipine, NMD）是选择性作用于脑血管和神经元的双氢吡啶类钙通道阻滞剂,除具有扩张脑血管,增加脑供血等作用外,还可以阻断钙通道,减轻钙超载,保护神经元。近年的研究表明,尼莫地平可以改善多种原因导致的学习记忆障碍,但该药对癫痫后认知功能障碍的实验研究尚未见相关报道。有鉴于此,本文通过对突触可塑性及钙信号转导的研究,探讨癫痫后认知功能障碍的可能发生机制,并观察尼莫地平的脑保护作用。第一部分慢性癫痫大鼠模型的制备、行为学测定及尼莫地平的影响目的:建立戊四氮点燃慢性癫痫大鼠模型,观察其学习记忆能力的变化及尼莫地平的影响。方法:选用健康雄性SD大鼠,经两次Y-迷宫筛选合格后随机分四组。NC（normal control）组大鼠（35只）每日腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,共44 d。PTZ组（40只）每日腹腔注射1% PTZ 35 mg/kg,连续44 d,自给药第31天起,每日PTZ注射前15 min腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,共14 d。NMD1组（40只）及NMD2组（40只）每日腹腔注射1% PTZ 35 mg/kg,连续44 d,自给药第31天起,每日PTZ注射前15 min分别腹腔注射NMD 1.25 mg/kg、2.5 mg/kg ,共14 d。造模成功后描记脑电图（electroencephalogram, EEG）变化,并采用Morris水迷宫和Y-迷宫实验,进行大鼠学习和记忆成绩的测试。结果:大鼠在注射PTZ后第6～10天起开始出现凝视、点头、反复洗脸动作、面部及头部抽搐等,以后发作症状逐日加重,于给药第18～24天出现全身肌阵挛、双前肢抬起,最终发生全身强直-阵挛性发作,达到RacineⅣ～Ⅴ级的点燃标准,以后每天均有Ⅳ～Ⅴ级发作。第30天时PTZ组大鼠35只完全点燃,NMD1组34只完全点燃,NMD2组35只完全点燃。第31～44天,PTZ组大鼠每天仍有Ⅳ～Ⅴ级癫痫发作,NMD1和NMD2组大鼠癫痫发作程度减轻。NC组大鼠自始至终无癫痫发作表现。EEG表现:NC组大鼠EEG以α、β波为主,背景正常,无异常放电现象。PTZ组大鼠EEG表现为在基础波背景下,阵发性出现大量高幅尖波、棘波、棘慢复合波,持续1～2 s。NMD1组和NMD2组大鼠EEG表现为痫性放电受到抑制,在基础波背景下可见散在少量棘波或尖波,波幅降低。Morris水迷宫实验中定位航行实验结果:每日逃避潜伏期取其平均值进行比较。第1天,四组大鼠的逃避潜伏期比较无统计学意义（P>0.05）;第2天,与NC组的逃避潜伏期（15.14±4.69）s比较,PTZ组逃避潜伏期（27.36±6.13）s明显延长（ P<0.05）;NMD1组和NMD2组的逃避潜伏期（21.66±5.21）s及（19.76±5.81）s较PTZ组缩短（ P<0.05）,但与NC组比较明显延长（P<0.05）;NMD1组和NMD2组的逃避潜伏期比较无统计学意义。第3天,PTZ组大鼠的逃避潜伏期（7.71±1.30）s与NC组（4.46±1.11）s比较有显著性差异（P<0.01）;NMD1组和NMD2组的逃避潜伏期（5.94±1.19）s及（5.69±1.03）s仍短于PTZ组（ P<0.05）,但长于NC组（ P<0.05）;NMD1组和NMD2组的逃避潜伏期比较无统计学意义（P>0.05）。空间探索试验结果:PTZ组大鼠120 s内穿越平台区域的次数（5.73±2.14）明显低于NC组（9.25±2.18）（ P<0.01）;NMD1、NMD2组大鼠120 s内穿越平台区域的次数（8.58±2.12）及（7.51±2.05）与PTZ组比较明显增多（P<0.01）,但与NC组比较无统计学意义（P>0.05）;NMD1组和NMD2组大鼠120 s内穿越平台区域的次数二者比较无统计学意义（P>0.05）。在平台象限的游泳时间四组比较无显著性差异（P>0.05）。Y迷宫检测结果:PTZ组大鼠的错误反应次数（error number, EN）（12.75±2.50）与NC组（6.25±3.10）比较明显增多（P<0.05）;NMD1组和NMD2组的错误反应次数（8.75±2.22）和（8.00±3.16）与PTZ组比较又明显减少（P<0.05）,但NMD1组和NMD2组与NC组比较无显著性差异（P>0.05）;NMD1组和NMD2组比较也无显著性差异（P>0.05）。全天总反应时间四组比较无统计学意义（P>0.05）。结论:本实验建立的戊四氮点燃癫痫大鼠模型类似人类慢性癫痫发作,且具备学习和记忆能力缺损,是研究癫痫后认知功能障碍比较理想的动物模型,尼莫地平可以部分改善慢性癫痫大鼠的学习记忆功能缺损。第二部分慢性癫痫大鼠海马突触后致密物95与突触素表达的变化及尼莫地平的影响目的:观察戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马P38及PSD-95表达的变化及尼莫地平的影响,探讨P38及PSD-95在癫痫后认知功能障碍中的作用与意义。方法:每组大鼠各取8只,10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取含海马脑段,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行PSD-95及P38免疫组化染色,测定免疫反应产物吸光度。每组大鼠各取8只,迅速分离海马,Trizol提取总RNA,应用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测定大鼠海马PSD-95 mRNA表达的变化。结果:PSD-95免疫组化图像分析结果显示:与NC组大鼠海马CA1区PSD-95免疫反应产物吸光度（0.7108±0.0584）比较,PTZ组大鼠海马CA1区PSD-95免疫反应产物吸光度（0.6525±0.0648）明显减少（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1组海马CA1区PSD-95免疫反应产物吸光度（0.6921±0.0620）和NMD2组海马CA1区PSD-95免疫反应产物吸光度（0.7033±0.0659）均明显增加（P<0.05）;NMD1组、NMD2组及NC组PSD-95免疫反应产物吸光度无明显差异（P>0.05）。P38免疫组化图像分析结果显示:与NC组大鼠海马CA1区P38免疫反应产物吸光度（0.6033±0.0444）比较,PTZ组大鼠P38免疫反应产物吸光度（0.4475±0.0505）明显减少（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组P38免疫反应产物吸光度（0.5819±0.0367）和（0.5723±0.0528）均明显增加（P<0.05）。NMD1、NMD2组及NC组P38免疫反应产物吸光度三组比较无明显统计学差异（P>0.05）。各组大鼠海马PSD-95 mRNA的表达水平以PSD-95 mRNA/β-actin mRNA表示。结果显示:与NC组PSD-95 mRNA表达水平（0.607±0.051）比较,PTZ组PSD-95 mRNA表达水平（0.325±0.030）明显降低（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1和NMD2组PSD-95 mRNA表达水平（0.512±0.035）及（0.575±0.041）明显增高（P<0.05）;NMD1、NMD2组及NC组PSD-95 mRNA表达水平三组比较无明显统计学差异（P>0.05）。结论:PTZ点燃癫痫大鼠海马组织P38、PSD-95及PSD-95 mRNA表达水平均降低,并且与大鼠学习和记忆成绩下降相一致,提示P38及PSD-95可能参与了癫痫后认知功能障碍的发病机制;尼莫地平可以提高癫痫大鼠海马组织P38蛋白、PSD-95蛋白及mRNA表达水平,进而促进癫痫大鼠学习和记忆能力改善。第三部分慢性癫痫大鼠海马神经元和突触超微结构的变化及尼莫地平的影响目的:观察戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马CA1区神经元形态结构和突触超微结构（SVD、PSD、WSC）的变化及尼莫地平的干预作用,探讨突触可塑性与癫痫后认知功能障碍的关系。方法:每组大鼠各取3只,10%水合氯醛麻醉,4 %多聚甲醛（含2.5 %戊二醛）灌注固定,利用透射电子显微镜观察各组大鼠海马CA1区神经元形态结构和突触超微结构（SVD、PSD、WSC）的变化。结果:NC组海马神经元形态完整,结构清晰,细胞器丰富,有髓神经髓鞘完整。PTZ组海马神经元减少,细胞核肿胀,核膜模糊不清,核内异染色质减少分散,胞核疏松、透明,出现核固缩现象。细胞器明显减少,线粒体空泡化或均质化。粗面内质网板层离散,核糖体脱颗粒。神经毡水肿变形,有些轴突、树突扩张、融合。可见髓鞘层裂。NMD1组及NMD2组海马神经元和神经毡水肿减轻,核膜尚完整,核形态基本正常,染色质均匀分布,胞质中细胞器尚丰富,形态基本正常。NC组海马CA1区神经毡内Gray I型突触丰富,突触前、后膜清晰,囊泡密集,PSD较厚,均匀致密。PTZ组突触数量减少,突触前、后膜模糊不清,突触间隙增大,PSD变薄,不均匀,突触囊泡减少。NMD1组和NMD2组突触数量较多,突触前后膜结构较清晰,PSD尚均匀,突触囊泡数量较多。PTZ组大鼠海马CA1区PSD为（31.37±1.94）nm,与NC组（49.86±3.38）nm比较有显著性差异（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1组大鼠海马CA1区PSD（45.69±2.70）nm和NMD2组（48.20±2.15）nm明显增高（P<0.05）;NMD1、NMD2组及NC组大鼠海马CA1区PSD三组比较无明显统计学差异（P>0.05）。与NC组大鼠海马CA1区WSC（14.62±1.19）nm比较,PTZ组WSC（22.34±1.84）nm显著增大（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1组大鼠海马CA1区WSC（16.37±1.72）nm和NMD2组WSC（15.02±1.63）nm明显减小（P<0.05）;NMD1组、NMD2组及NC组大鼠海马CA1区WSC三组比较无明显统计学差异（P>0.05）。与NC组大鼠海马CA1区SVD（3362.61±102.08）个/um2比较,PTZ组SVD（1078.36±111.03）个/um2明显减少（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1组大鼠海马CA1区SVD（2932.01±142.95）个/um2和NMD2组SVD（3155.50±137.49）个/um2明显增高（P<0.05）;NMD1、NMD2组及NC组三组大鼠海马CA1区SVD比较无明显统计学差异（P>0.05）。结论:癫痫大鼠海马CA1区存在神经元与突触超微结构异常,尼莫地平可以改善神经元及突触超微结构的病理学变化,这些与癫痫大鼠学习和记忆能力的变化相平行,说明突触可塑性与癫痫后认知功能障碍之间存在密切关系。第四部分慢性癫痫大鼠海马[Ca2+]i和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα的变化及尼莫地平的影响目的:观察戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马[Ca2+]i及CaMK IIα, P-CaMK IIα蛋白、CaMK IIαmRNA表达的变化及尼莫地平的干预作用,探讨钙信号转导与癫痫后认知功能障碍的关系。方法:每组大鼠各取6只,10%水合氯醛麻醉,迅速取海马,制备海马组织混悬液,负载Fluo-3/AM,采用流式细胞分析技术测定各组大鼠海马细胞[Ca2+]i变化; RT-PCR方法检测CaMK IIαmRNA表达的变化。每组大鼠各取8只,10%水合氯醛麻醉,迅速取海马,提取海马总蛋白及膜蛋白,Western blot方法检测海马CaMK IIα, P-CaMK IIα蛋白表达的变化。结果:与NC组[Ca2+]i（1.26±0.21）比较,PTZ组海马[Ca2+]i（1.94±0.33）明显升高（P<0.05）;与PTZ组[Ca2+]i比较,NMD1组[Ca2+]i（1.35±0.28）和NMD2组[Ca2+]i（1.32±0.26）明显降低（P<0.05）;NMD1、NMD2组和NC组海马[Ca2+]i之间无明显差异（P>0.05）。各组大鼠海马CaMK IIα蛋白表达水平以CaMK IIα/β-actin表示。结果显示:与NC组CaMK IIα表达水平（1.030±0.133）比较,PTZ组CaMK IIα表达水平（0.700±0.061）显著降低（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组CaMK IIα表达水平（1.000±0.130）、（0.981±0.071）显著升高（P<0.05）;NC组和NMD1、NMD2组大鼠海马CaMK IIα表达水平之间无明显差异（P>0.05）。各组大鼠海马P-CaMK IIα蛋白表达水平以P-CaMK IIα/β-actin表示。结果显示:与NC组P-CaMK IIα表达水平（0.693±0.035）比较,PTZ组P-CaMK IIα表达水平（0.250±0.036）显著降低（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组P-CaMK IIα表达水平（0.679±0.058）、（0.665±0.043）显著升高（P<0.05）;NC组、NMD1和NMD2组P-CaMK IIα表达水平无显著性差异（P>0.05）。大鼠海马CaMK IIαmRNA表达水平以CaMK IIαmRNA/β-actin mRNA表示。结果显示,与NC组CaMK IIαmRNA表达水平（1.217±0.074）比较,PTZ组CaMK IIαmRNA表达水平（0.758±0.050）明显降低（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组CaMK IIαmRNA表达水平（1.149±0.083）、（1.300±0.071）明显增高（P<0.05）;NMD1、NMD2组及NC组大鼠CaMK IIαmRNA表达水平无明显统计学差异（P>0.05）。结论:戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马内存在钙超载及P-CaMK IIα,CaMK IIα蛋白及CaMK IIαmRNA表达水平降低,导致钙信号转导异常,可能参与了癫痫后认知功能障碍的发病机制;尼莫地平可以调节海马[Ca2+]i水平,增强P-CaMK IIα,CaMK IIα蛋白及CaMK IIαmRNA表达水平,与它提高癫痫大鼠学习记忆成绩相一致,提示尼莫地平具有改善认知功能的药理学作用。第五部分慢性癫痫大鼠海马CREB表达水平的变化及尼莫地平的影响目的:观察戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马P-CREB蛋白及CREB mRNA表达的变化及尼莫地平的干预作用,探讨核转录因子CREB表达与癫痫后认知功能障碍的关系。方法:Western blot方法检测海马P-CREB（Ser133）蛋白表达的变化, RT-PCR方法检测CREB mRNA表达的变化。结果:各组大鼠海马P-CREB（Ser133）表达水平以P-CREB/β-actin表示。结果显示:与NC组P-CREB表达水平（0.643±0.054）比较,PTZ组大鼠海马P-CREB表达水平（0.275±0.041）显著降低（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组P-CREB表达水平（0.602±0.045）、（0.621±0.071）显著升高（P<0.05）;NC组及NMD1、NMD2组大鼠海马P-CREB蛋白表达水平比较无显著性差异（P>0.05）。各组大鼠海马CREB mRNA表达水平以CREB mRNA/β-actin mRNA表示。结果显示,与NC组CREB mRNA表达水平（0.605±0.071）比较,PTZ组CREB mRNA表达水平（0.319±0.037）明显降低（P<0.05）;与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组CREB mRNA表达水平（0.560±0.058）、（0.582±0.083）明显增高（P<0.05）;NMD1、NMD2组及NC组大鼠海马CREB mRNA表达水平之间无明显统计学差异（P>0.05）。结论:慢性癫痫大鼠海马CREB蛋白磷酸化水平及转录水平下调,尼莫地平可以提高CREB蛋白及转录水平,这与其学习和记忆成绩变化相一致,提示核转录因子CREB可能参与了癫痫后认知功能障碍的发病机制。
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