DDT降解细菌KK的分离鉴定及其降解特性研究

论文摘要

本文以有机氯杀虫剂DDT作为研究对象,采用微生物的富集分离法筛选出一株DDT的高效降解细菌——产碱菌属KK,并对该菌株进行了形态学、生理生化及16S rDNA鉴定,对降解微生物的富集分离、环境条件对KK菌株降解能力的影响以及该菌的降解特性等方面进行了系统的讨论,主要研究内容如下:1.介绍了DDT的理化性质、国内外应用概况,以及由于其广泛应用所带来的环境污染问题;在对前人工作总结分析的基础上,对DDT在环境介质中的残留动态、降解代谢、生态毒理及微生物降解进行了全面系统的综述;进而提出了作者要研究的问题。2.通过富集培养法和直接培养法分离出数株DDT的高效降解菌,同时研究实验室内部细菌对DDT的降解率,最终获得三株DDT的高效降解细菌。三株菌在30℃、中性条件下,3d内对10mg·L-1的DDT均达到45%以上,其中以KK对DDT的降解率最高,经过对其形态、生理生化特征及16S rDNA的分析,鉴定为产碱菌属（Alcaligenes sp.）,最终选定DDT高效降解细菌KK作为下一步深入研究的菌株。3.测定了不同碳源、pH、温度及DDT浓度对细菌降解能力和生长量的影响。结果表明,该菌株10d内对10mg·L-1DDT的降解率高达66.5%;在外加碳源浓度为0.5%时降解率最大;细菌的生长量随着外加碳源浓度的升高而增加; pH6.0时降解率达到最大,细菌的生长量在pH8.010.0偏碱性的条件下较大;在DDT浓度为10mg·L-1时降解率最大,该菌具有较强的耐受能力,当DDT浓度达到300mg·L-1时仍能生长,降解率随DDT浓度的提高而增加;细菌的生长和降解需要适宜的温度,30℃培养时,降解率和生长量最大。4. DDT初步代谢产物的分析。本研究中通过GC-MS分析,使用PE自带数据库分析系统,结合人工物质解析。初步确定菌株KK对p,p’-DDT的初级代谢产物为p,p′-DDE,下一步降解途径需深一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略表
• 1. 前言
• 1.1 DDT 的结构和理化性质
• 1.2 DDT 的应用概况
• 1.3 DDT 在应用中存在的问题
• 1.4 DDT 在环境中的残留状况
• 1.4.1 DDT 在植物中的残留
• 1.4.2 DDT 在土壤中的残留
• 1.4.3 DDT 在水体中的残留
• 1.4.4 DDT 在大气中的残留
• 1.5 DDT 的生态毒理学效应
• 1.5.1 DDT 对生物的毒理学效应
• 1.5.2 DDT 对人体的毒理学效应
• 1.6 环境污染的生物修复研究
• 1.6.1 生物修复研究概述
• 1.6.2 农药残留污染的微生物降解
• 1.6.2.1 农药降解的微生物种类
• 1.6.2.2 农药的微生物降解基础
• 1.6.3 影响微生物降解农药污染的因素
• 1.6.3.1 污染物的化学结构
• 1.6.3.2 污染物的生物可利用性
• 1.6.3.3 微生物的降解能力
• 1.6.3.4 微生物降解活性的影响因素
• 1.7 DDT 微生物降解的研究进展
• 1.7.1 DDT 动物降解的研究进展
• 1.7.2 DDT 植物降解的研究
• 1.7.3 DDT 微生物降解的研究进展
• 1.7.4 DDT 微生物降解的降解机制
• 1.7.4.1 细菌对 DDT 降解途径
• 1.7.4.2 真菌对 DDT 降解途径的研究
• 1.8 本文研究内容
• 2. 材料与方法
• 2.1 药品试剂
• 2.2 仪器设备
• 2.3 培养基
• 2.3.1 无机盐基础培养基
• 2.3.2 分离纯化培养基
• 2.3.3 LB 富集培养基
• 2.3.4 含少量碳源培养基
• 2.4 细菌生长量的测定方法
• 2.5 液体培养基中DDT 的提取及测定
• 2.5.1 培养液中 DDT 的提取
• 2.5.2 DDT 的测定
• 2.6 DDT 降解率的计算
• 2.6.1 菌悬液对 DDT 降解率的计算
• 2.6.2 GC 测定DDT 的含量
• 2.7 微生物的富集与分离
• 2.7.1 菌源的采集
• 2.7.2 降解微生物的富集、分离
• 2.8 DDT 降解细菌的筛选
• 2.8.1 菌悬液的制备
• 2.8.2 降解能力的测定
• 2.9 DDT 高效降解细菌KK 的鉴定
• 2.9.1 细菌的菌落形态及生理生化鉴定
• 2.9.2 细菌的16S rDNA 鉴定
• 2.9.2.1 模板 DNA 的提取
• 2.9.2.2 配制PCR 反应液
• 2.9.2.3 PCR 反应条件
• 2.9.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.9.2.5 PCR 产物的回收及DNA 测序
• 2.9.2.6 结果比对
• 2.10 DDT 高效降解细菌KK 的降解特性研究
• 2.10.1 菌株KK 的生长曲线和DDT 降解曲线
• 2.10.2 外加碳源浓度对降解细菌生长和降解能力的影响
• 2.10.3 初始pH 值对降解细菌的生长和降解能力的影响
• 2.10.4 DDT 浓度对降解细菌的生长和降解能力的影响
• 2.10.5 培养温度对降解细菌的生长和降解能力的影响
• 2.11 DDT 初级代谢产物的分析
• 2.11.1 代谢产物分析降解液的准备及提取
• 2.11.2 气-质分析条件
• 2.11.3 图谱分析方法
• 2.12 降解 DDT 相关基因定位的初步研究
• 3. 结果与分析
• 3.1 DDT 的 GC-ECD 残留测定方法的建立
• 3.1.1 分析方法的线性关系与相关性
• 3.1.2 分析方法的可靠性测定
• 3.1.2.1 培养液中DDT 残留测定方法的可靠性分析
• 3.1.2.2 DDT 在GC-ECD 条件下的色谱图
• 3.2 DDT 降解细菌的筛选以及高效降解细菌KK 鉴定
• 3.2.1 降解细菌的筛选
• 3.2.2 高效降解菌KK 的鉴定
• 3.2.2.1 细菌的形态及生理生化鉴定
• 3.2.2.2 细菌的165 rDNA 鉴定
• 3.2.2.2.1 降解菌KK 总DNA 提取
• 3.2.2.2.2 PCR 产物的琼脂糖凝胶回收
• 3.2.2.2.3 KK 菌株系统发育树的构建
• 3.3 高效降解菌KK 的降解特性研究
• 3.3.1 菌株KK的生长曲线和DDT降解曲线
• 3.3.2 外加碳源浓度对降解细菌生长和降解率的影响
• 3.3.3 初始pH 值对降解细菌生长及降解率的影响
• 3.3.4 DDT 浓度对降解细菌的生长和降解能力的影响
• 3.3.5 培养温度对降解细菌的生长和降解能力的影响
• 3.4 DDT 初步代谢产物的分析
• 3.4.1 降解提取液的总离子流图谱
• 3.5 降解 DDT 相关基因定位的初步研究
• 4. 讨论
• 4.1 有机氯农药残留微生物降解技术研究概况
• 4.1.1 有机氯农药降解菌的获取途径
• 4.1.1.1 从自然环境中筛选优良菌种
• 4.1.1.2 人工获取降解菌的方法
• 4.1.2 降解有机氯农药的微生物种类
• 4.1.3 微生物对有机氯农药的代谢方式
• 4.1.4 有机氯农药微生物降解效果的评价
• 4.1.5 环境影响因子的调控
• 4.1.6 有机氯降解酶的种类
• 4.2 初级代谢产物 DDE 的生物降解研究
• 4.2.1 DDE 的来源、性质
• 4.2.2 DDE 的生物降解
• 5. 结论
• 5.1 筛选出数株 DDT 的高效降解细菌
• 5.2 明确了 DDT 高效降解细菌的降解特性
• 6. 本研究的创新之处
• 7. 参考文献
• 8. 附录
• 9. 致谢
• 10. 攻读学位期间发表论文情况