与双生病毒/卫星复合物伴随的DNA1分子的结构及其功能研究

论文摘要

双生病毒在世界范围内广泛发生,并已在多种作物上造成毁灭性危害。自20世纪90年代起,在我国广西、云南和海南等地也相继发现烟草、番茄、南瓜和番木瓜等多种作物遭受双生病毒的危害。近年来,在寻找胜红蓟黄脉病毒（Ageratum yellow vein virus,AYVV）和木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV）的致病相关因子的时候,发现了两种小分子DNA,分别称为DNAβ和DNAl。DNAl分布广泛,但是生物学功能还不清楚。为了明确DNAl在我国的分布情况、生物学功能及其在双生病毒进化上的影响,我们对从云南省采集的双生病毒样本中的DNA分子开展了研究。 利用PCR及Southern印迹在烟草曲茎病毒（Tobacco curl shoot virus,TbCSV）的分离物Y35和Y115中发现DNA1分子,DNA1是一个环状单链DNA分子,并且只与含卫星DNAβ的TbCSV分离物相伴随。免疫捕获PCR实验表明DNA1分子包裹在双生病毒粒子中,并伴随病毒由烟粉虱传播。 对云南烟草、番茄、胜红蓟、赛葵和稀硷等作物的近300个双生病毒分离物,进行PCR鉴定,发现只有在烟草、番茄、胜红蓟的部分分离物中检测到DNA1,并且这些分离物都是由双生病毒和DNAβ共同侵染的,但不是所有含DNAβ的双生病毒都存在DNA1。对28个与含卫星DNAβ的双生病毒相伴随的DNA1分子的全基因组序列分析比较发现,DNA1分子大小为病毒DNA的一半,与双生病毒DNA-A和DNA-B几乎没有同源性,并具有以下保守的结构特征:含有在大多数矮缩病毒属病毒（nanoviruses）中保守的九核苷酸TAGTATTAC和双生病毒的茎环结构;病毒链都编码一个大小约为36～37 kDa的类似nanoviruses的复制相关蛋白;在编码Rep基因的ORE下游有一个富含A的区域（A-rich）,A-rich的大小在153-169 nt,A的含量在52.3-58.4%之间。对28个DNA1分子的序列比较发现,它们的全序列核苷酸的相似性为66.5-99.7%,可分成四类,除Y89 DNA1外,其余三类分别与TbCSV、云南烟草曲叶病毒（Tobacco leaf curl Yunnan virus,TbLCYNV）及中国番茄黄曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）相伴随,Y89 DNAl的辅助病毒还有待确定。28个DNA1分子的Rep编码有315个氨基酸,其氨基酸序列都较保守,相似性都在88.3%以上,与其它报道的DNA1 Rep的氨基酸相似性

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.双生病毒的特性
• 1.1 双生病毒的分类
• 1.2 双生病毒的基因组结构和功能
• 1.3 双生病毒的侵染
• 2.双生病毒的危害性
• 2.1 双生病毒的危害及其经济重要性
• 2.2 重组是双生病毒变异和病害流行的重要因素
• 3.单组份双生病毒的致病因子——DNAβ
• 4.Nanovirus类小分子的发现
• 4.1 DNA1的基因组结构
• 4.2 DNA1的生物学功能
• 5.DNA1与begomovirus／DNAβ形成一种新型的病害复合体
• 6.DNA1与begomovirus／DNAβ的进化关系
• 7.存在的问题
• 第二章 材料与方法
• 1.材料
• 1.1 病毒
• 1.2 常用化学试剂分子生物学试剂及仪器
• 1.3 常用缓冲液的配制
• 2.方法
• 2.1 植物总DNA提取
• 2.2 免疫捕获PCR
• 2.3 PCR反应
• 2.4 割胶回收
• 2.5 DNA克隆技术
• 2.6 测序
• 2.7 序列分析
• 2.8 Southern blot分析
• 2.9 地高辛杂交方法
• 第三章 与双生病毒／卫星复合物伴随的nanovirus类DNA分子鉴定及其结构多样性分析
• 1.材料与方法
• 1.1 病毒
• 1.2 总DNA提取
• 1.3 PCR扩增
• 1.4 克隆
• 1.5 Southern blot杂交
• 1.6 免疫捕获PCR（Immunotrapping PCR，IT-PCR）
• 1.7 测序及序列分析
• 2.结果与分析
• 2.1 与含卫星DNA-β的烟草曲茎病毒伴随的DNA1分子的鉴定
• 2.2 DNA1由TbCSV外壳蛋白包裹
• 2.3 与中国云南粉虱传双生病毒伴随的DNA1分子的鉴定
• 2.4 与云南粉虱传双生病毒伴随的DNA1的序列测定
• 2.5 与云南粉虱传双生病毒伴随的DNA1的结构特征
• 2.6 与云南粉虱传双生病毒伴随的DNA1的序列分析
• 2.7 与begomoviruses伴随的DNA1分子与nanoviruses小分子的进化分析
• 2.8 与云南粉虱传双生病毒伴随的DNA1分子的复合侵染
• 3.讨论
• 第四章 DNA1与烟草曲茎病毒及其伴随的卫星DNAβ之间的互作
• 1.材料与方法
• 1.1 TbCSV-Y35 DNAl和TbLCYNV-Y132 DNA1的侵染性克隆构建
• 1.2 农杆菌介导的植株接种
• 1.3 病毒DNA的Southern印迹检测
• 1.4 叶盘法检测病毒基因组的复制
• 2.结果与分析
• 2.1 TbCSV-Y35 DNA1和TbLCYNV-Y132 DNA1的侵染性克隆构建
• 2.2 TbCSV-Y35 DNA1和TbLCYNV-Y132 DNA1的侵染性测定
• 2.3 DNA1复制能力的鉴定
• 2.4 TbCSV-Y35 DNA1的致病性检测
• 2.5 DNA1对病毒及其伴随卫星DNA积累水平的作用
• 2.6 异源TbLCYNV-Y132 DNA1与TbCSV-Y35及其伴随的卫星DNAβ之间的互作
• 3.讨论
• 参考文献
• 附录A：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 附录B：常用试剂的配制
• 研究生期间发表的学术论文