黑曲霉糖化酶基因启动子功能鉴定及菌株遗传改良

论文摘要

糖化酶是目前最重要的工业酶制剂之一,广泛应用于将淀粉糖化产物作为原料的发酵工业。Aspergillus niger CICIM F0410是国内生产糖化酶的代表菌株之一。本文克隆了A. niger F0410糖化酶基因的启动子,对其核苷酸序列进行了测定,在大肠杆菌中鉴定了该启动子的功能,并进一步探讨了其在糖化酶工业生产菌株遗传改良中的应用。本文首先通过PCR扩增到A. niger F0410糖化酶基因启动子PglaA并测定其核苷酸序列,通过分析核苷酸序列并与GenBank上登录号为X00712的黑曲霉糖化酶基因启动子序列进行比对,结果表明,两启动子核苷酸序列同源性为99.45%,有5个位置的碱基变化,包括1个位点缺失和4个位点替换。将克隆得到的糖化酶基因启动子PglaA替换质粒pRS303K上KmR基因启动子,构建成糖化酶基因启动子功能检测质粒pRS-PglaA-KmR,将pRS-PglaA-KmR转入E. coli JM109中,得到重组菌E. coli（pRS-PglaA-KmR）。通过对重组菌的氨基糖苷磷酸转移酶基因活性检测,表明PglaA在E. coli中具有驱动KmR基因表达的活性。采用不同诱导物对该启动子诱导发现,葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和玉米淀粉,可以不同程度增强PglaA的强度。用糖化酶基因启动子PglaA替换质粒pRS303H上HygR基因启动子,构建成重组质粒pRS-PglaA-HygR,通过PEG介导的原生质体转化方法转化糖化酶工业生产菌株A. niger F0410,通过潮霉素B作为筛选标记获得转化子,并通过PCR对转化子进行了进一步确认,结果表明成功将重组质粒pRS-PglaA-HygR整合到工业菌株A. niger F0410染色体中。通过摇瓶发酵实验和潮霉素B抗性稳定性实验,获得一株与出发菌株产糖化酶活力无明显改变、抗性稳定的转化子GAH14,对其进行亚硝基胍诱变,筛选潮霉素B抗性提高的转化子进行摇瓶发酵实验,并测定其糖化酶酶活。经初筛和复筛,最终获得了糖化酶活力比出发菌株提高了8.8%的转化子GAN12。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 基因启动子克隆方法
• 1.1.1 启动子探针质粒载体筛选启动子
• 1.1.2 利用PCR 技术克隆启动子
• 1.2 真核生物基因启动子特点
• 1.3 黑曲霉糖化酶基因表达调控研究
• 1.4 黑曲霉的转化技术
• 1.5 提高糖化酶活力的研究
• 1.6 糖化酶的应用
• 1.7 本课题立题背景和研究内容
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 工具酶和试剂
• 2.3 培养基和培养条件
• 2.4 A .NIGER F0410 染色体提取（CTAB 法）
• 2.4.1 CTAB 溶液配制
• 2.4.2 提取步骤
• 2.5 黑曲霉糖化酶基因启动子序列PCR 扩增
• 2.6 黑曲霉糖化酶基因启动子序列测定
• 2.7 DNA 序列比对与分析
• 2.8 感受态细胞制备
• 2.9 重组质粒的构建
• 2.9.1 DNA 酶切反应
• 2.9.2 DNA 片段胶回收
• 2.9.3 DNA 片段连接反应
• 2.10 快速小量抽提质粒DNA
• 2.11 黑曲霉糖化酶基因启动子功能鉴定
• 2.11.1 黑曲霉糖化基因启动子在E.coli JM109 中功能检测
• glaA 的影响分析'>2.11.2 不同诱导物对糖化酶基因启动子P_glaA的影响分析
• 2.12 黑曲霉原生质体制备
• 2.13 黑曲霉原生质体转化
• 2.13.1 重组质粒线性化
• 2.13.2 黑曲霉原生质体对潮霉素B 最低抑菌浓度的确定
• 2.13.3 黑曲霉原生质体转化方法
• 2.13.4 转化子PCR 方法鉴定
• 2.14 转化子诱变
• 2.14.1 转化子最低抑菌浓度的确定
• 2.14.2 转化子单细胞悬液制备
• 2.14.3 化学诱变步骤
• 2.15 摇瓶发酵试验
• 2.16 酶活测定
• 2.16.1 试剂及其配制
• 2.16.2 测定方法
• 2.16.3 标准曲线的绘制
• 2.16.4 酶活计算方法
• 2.17 主要仪器
• 3 结果与分析
• 3.1 糖化酶基因启动子序列扩增、测定及分析
• 3.1.1 A. niger F0410 染色体的提取
• 3.1.2 糖化酶基因启动子PCR 扩增
• 3.1.3 糖化酶基因启动子在pBlueScriptⅡSK（-）中的亚克隆
• 3.1.4 糖化酶基因启动子序列测定及分析
• 3.2 糖化酶基因启动子功能鉴定
• 3.2.1 用卡那霉素为筛选标记的启动子功能鉴定重组质粒的构建
• 3.2.2 黑曲霉糖化酶基因启动子在E. coli JM109 中功能检测
• 3.2.3 不同诱导物对黑曲霉糖化酶基因启动子的影响
• 3.3 黑曲霉原生质体转化
• 3.3.1 重组质粒pRS-PglaA-HygR 的构建
• 3.3.2 黑曲霉原生质体和菌丝体对潮霉素B 最低抑菌浓度的确定
• 3.3.3 黑曲霉原生质体的制备
• 3.3.4 重组质粒线性化与未线性化对转化率影响
• 3.3.5 黑曲霉原生质体转化子筛选
• 3.3.6 A. niger F0410 转化子PCR 验证
• 3.3.7 黑曲霉转化子抗性稳定实验
• 3.3.8 黑曲霉转化子摇瓶发酵实验
• 3.4 黑曲霉转化子亚硝基胍诱变
• 3.4.1 黑曲霉转化子对潮霉素B 最低抑菌浓度的确定
• 3.4.2 黑曲霉转化子亚硝基胍诱变
• 3.4.3 诱变转化子摇瓶发酵结果
• 4 讨论
• 论文主要结论
• 1. 糖化酶基因启动子克隆、序列测定及分析
• glaA-Km^R的构建与糖化酶基因启动子功能鉴定'>2. 重组质粒pRS-P_glaA-Km^R的构建与糖化酶基因启动子功能鉴定
• glaA-Hyg^R的构建与黑曲霉原生质体转化'>3. 重组质粒pRS-P_glaA-Hyg^R的构建与黑曲霉原生质体转化
• 4. 转化子亚硝基胍诱变及高产糖化酶菌株筛选
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文